实验二-萌发麦苗淀粉酶活性的测定.pdfVIP

实验二 萌发麦苗淀粉酶活性的测定 生物 112 周泓兆 1102040226 一、研究背景及目的 酶作为生物体内最重要的催化剂，其活性尤其受到关注。在这次实验中，我们将对一些 经典经典酶活力测定实验进行分析，对比其思路与设计差异，了解测定酶活力的基本方向和 实验技巧。完成小麦萌发过程中淀粉酶活力的测定并分析测定结果是否合理。 二、原理 淀粉在淀粉酶的催化作用下生成麦芽糖。本实验便是通过测定淀粉酶在一定时间内分解 淀粉所产生的麦芽糖总量来测定酶的活性。根据其催化产物的特点 和现有测定方法规定酶 -1 -1 活力单位为：每分钟每克鲜重麦种所催化生成的麦芽糖毫克数（毫克麦芽糖*克 鲜重*分 ）。 本实验涉及α-淀粉酶与β-淀粉酶，我们可通过钝化β-淀粉酶的方法单独测定α-淀粉 酶的活性。 本实验所使用的 3,5－二硝基水杨酸法是一种对还原糖定量测定的方法。还原糖和碱性 二硝基水杨酸试剂一起共热，产生一种棕红色的氨基化合物，在一定的浓度范围内，棕红色 物质颜色的深浅程度与还原糖的量成正比。因此，我们可以测定样品中还原糖以及总糖的量。 麦芽糖是还原性糖，可用该方法对其含量进行测定。 三、仪器与试剂 1.仪器：TDL-40B 离心机（上海安亭科学仪器厂），722 光栅分光光度计（上海精密科学 仪 器有限公司） ，DK-S24 型电热恒温水浴锅（上海精宏实验设备有限公司），JP-100 架盘药 物天平（常熟市双杰测试仪器厂），HCTP12A1 架盘药物天平（北京医用天平厂） 2.试剂：麦芽糖标准液，pH5.6 的柠檬酸缓冲液 ，3,5-二硝基水杨酸溶液，0.4M NaOH， Folin-酚试剂甲，Folin-酚试剂乙，标准牛血清白蛋白溶液（1mg/ml ） 3.材料：萌发的小麦种子（芽长约 1cm） 四、实验方法/操作步骤 1、酶液的制备：称取两克萌发的小麦种子（芽长一厘米左右），置研钵中加少量石英砂，以 蒸馏水作为匀浆液，研磨成匀浆，转移到 50ml 容量瓶中至 40ml 左右，室温浸提 15-20 分钟， 浸提充分后定容至刻度，混匀后 3500r/min 离心 20min，取上清液备用（初始酶液）。 2、取 15 支试管，分别编号α-测定管 1、α-测定管 2、α-对照管 1、α-对照管 2、α+ β- 测定管 1、α+ β-测定管 2、α+ β-对照管 1、α+ β-对照管 2 与 1、2、3、4、5、6、7。 3、在α-测定管 1、α-测定管 2、α-对照管 1、α-对照管 2 中各加入酶液 1ml 在 70℃恒温 水浴中准确加热 15min，取出后立即在冰浴中冷却至室温或更低。取出后分别在四支试管中 各加入 1mlpH5.6 柠檬酸缓冲液，置于 40℃恒温水浴中准确保温 15min。之后向两支对照管 中各加入4ml 0.4M NaOH，再向各管分别加入40℃下预热的淀粉溶液 2ml，摇匀，立即于40 ℃水浴中准确保温 5min，然后向两支测定管分别迅速加入4ml 0.4M NaOH，摇匀备用。 4、取制备的酶液 5ml，放入 100ml 容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度，混合均匀后，在α+ β -测定管 1、α+ β-测定管 2、α+ β-对照管 1、α+ β-对照管 2 中各加入 1ml 稀释后的酶液 与 1mlpH5.6 柠檬酸缓冲液置于 40℃恒温水浴中准确保温 15min。之后向两支对照管中各加 入 4ml 0.4M NaOH，再向各管分别加入40℃下预热的淀粉溶液 2ml，摇匀，立即于40℃水浴 中准确保温 5min，然后向两支测定管分别迅速加入4ml 0.4M NaOH，摇匀备用。 5、取编号 1、2、3、4、5、6、7 的七支试管，分别加入麦芽糖标准液（1mg/ml）0、0.1、 0.3、0.5、0.7、0.9、1.0ml，然后将各管用蒸馏水准确补充至 1.0ml，摇匀。 6、在α-测定管 1、α-测定管 2、α-对照管 1、α-对照管 2、α+ β-测定管 1、α+ β-测 定管 2、α+ β-对照管 1、α+ β-对照管 2 与 1、2、3、4、5、6、7 管内各加入 1ml 3,5 二 硝基水杨酸试剂混匀，同时在沸水浴中准确保温 5min，取出冷却，用蒸馏水稀释到 15ml， 混匀。 7、依次取各试管溶液在 520nm 波长下进行比色，记录消光值。以 1、2、3、4、5、6、