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PCR 实验报告7 月 19 日 高遄实验目的：了解 PCR 技术原理，掌握最基础的PCR 实验步骤。实验试剂：模板 DNA，Mg2+，buffer，dNTPs，Taq DNA 聚合酶，引物，H2O，石蜡油。 实验原理：PCR 全称聚合酶链反应，是体外快速扩增特定基因或 DNA 序列最常用的方法。基本原理：首先将双链 DNA 分子在临近沸点的温度下加热分离成 2 条单链 DNA 分子， DNA 聚合酶以单链 DNA 为模板并利用反应混合物中的四种脱氧核苷三磷酸合成新的 DNA 互 补链。PCR 反应时，只要在试管内加入模板 DNA、PCR 引物、四种核苷酸及适当浓度的 Mg2+，DNA 聚合酶就能在数小时内将目标序列扩增 100 万倍以上。双链模板 DNA 分子首先在高温下解开成长的单链，短链引物分子立即与该模板 DNA两端的特定序列相结合，产生双链区。DNA 聚合酶从引物处开始复制其互补链，迅速产生与目标序列完全相同的复制品。在后续反应中，无论是起始模板 DNA 还是经复制的杂合 DNA 双链，都会在高温下解 开成为单链，体系中的引物分子再次与其互补序列相结合，聚合酶也再度复制模板DNA。由于在 PCR 反应中选用的一对引物，是按照与扩增区域两端序列彼此互补的原则设计 的，因此每一条新生链的合成都是从引物的退火结合位点开始并朝反方向延伸的，每 一条新合成的 DNA 链上都有新的引物结合位点。整个 PCR 的反应全过程，即 DNA 解链（变性）、引物与模板 DNA 结合（退火）、DNA 合成（链的延伸）三步可以被不断重复。经多次循环之后，反应混合物中所含有的双 链 DNA 分子数，即两条引物结合位点之间的 DNA 区段的拷贝数，理论上的最高值应该是 2^n，能进一步满足遗传分析的需要。? 试剂作用：引物：DNA 复制的起始点，针对复制 DNA 片段的两端，有 5’引物和 3’引物Taq DNA 聚合酶：促进 dNTPs 与模板结合。Buffer：Tris-HCl 反应缓冲液，Taq DNA 聚合酶提供一个最适酶催反应条件。Mg2+：对 PCR 扩增效率影响很大，浓度过高可降低 PCR 扩增的特异性，浓度过低则 影响 PCR 扩增产量甚至使 PCR 扩增失败而不出扩增条带。dNTPs：底物，在引物引导下合成与模板互补的 DNA 新链。石蜡油：防止 PCR 加热过程中 DNA 蒸发。? 试剂配置体积：20μl 体系中各试剂配置如下表：试剂H2OBufferMg2+dNTPsP（引物）T（模板）E（酶）体积/μl9224210.4? 温度和时间：（1） 热启动：94℃，5~10min（2） 变性：94℃，45~60s。（3） 退火：50~65℃，1min。退火温度计算：Tm-（5℃~10℃），Tm（解链温度）=4（G+C）+2（A+T）。（4） 延伸：72℃，1~1.5min。（5） 步骤（2）~（4）热循环 25~30 个周期（6） 保温：延伸 72℃，10min? 产物检测：凝胶电泳。实验步骤：（1）设计 20μl 体系各试剂配比：试剂H2OBufferMg2+dNTPsP（引物）T（模板）E（酶）体积/μl9224210.4（2）按照预先设计的 20μl 体积配置 6 管试管量，实际加入量如下表试剂H2OBufferMg2+dNTPsP（引物）T（模板）E（酶）6x 加入体积/μl541212暂不加入12暂不加入2.4将以上试剂按体积加入 EP 管中，震荡混匀后离心完成后分 6 管加入 pcr 管中，每管 15μl 体积，标注 1-6 号码。在前 1-~4 号PCR 管中加入模板 DNA，在 5 号管中加入C3H 模板作为阳性参照，6 号 中不加任何模板 DNA，作为阴性参照。在加完模板的 6 管试剂中各加入 20μl 石蜡油将 PCR 管放入 PCR 仪，按之前设定的加热温度与时间设置a．热启动：94℃，2min；80℃，1min； 此 时 在 各 管 中 加 入 dNTPs 4μl b． 变 性 ：94℃，30s； c． 退 火 ：65℃，1.5min； d．延伸：72℃，2min步骤 b~d 循环 40 次e．保温：72℃，10min（7）完成后用 3%琼脂糖凝胶（60ml）电泳进行检测。 实验结果：PCR 目标产物约为 295bp琼脂糖凝胶电泳结果如下图所示1 2 3 4 5 6 Marker1、2 号泳道为♂性小鼠 DNA 模板的 PCR 产物3、4 号泳道为♀性小鼠 DNA 模板的 PCR 产物号泳道为C3H 阳性参照号泳道为阴性参照由 Marker 参照可知，PCR 产物大小约为 290~300bp