lncRNA5926在山羊早期胚胎发育过程中的表达和功能研究.pdfVIP

摘要 摘要 哺乳动物早期胚胎发育过程中有一个重要的过渡即从母源向合子的转换。在这个 过程中，随着母源物质的消耗，合子基因组逐渐开始转录激活，称为合子基因组激活 (zygotic genome activation ，ZGA) ，ZGA 涉及到表观遗传修饰、染色质状态改变等一系 列生理过程。ZGA 对于胚胎发育是一个非常重要的过程，是胚胎学领域的研究重点。 随着高通量测序技术的发展，越来越多的研究发现基因组存在很多的非编码RNA ，长 度超过200 个核苷酸的被称为长链非编码RNA(long non-coding RNA ，lncRNA) 。lncRNA 曾被认为是基因序列中的“垃圾” 。然而，越来越多的证据表明lncRNA 对基因表达调控 有重要作用，一些 lncRNA 在早期胚胎中阶段特异性表达，对胚胎发育起着重要的调 控作用，然而其对于胚胎发育的功能和调控机制尚未全部解析清楚。 本研究首先筛选了山羊早期胚胎转录组数据中差异性表达的lncRNA ，对其预测的 靶基因进行文献查阅。我们以靶基因与胚胎发育相关为标准筛选出长链非编码 RNA TCONS （以下简称lnc5926 ）；然后，通过定量PCR 验证 lnc5926 在胚胎中 的表达模式，通过敲降实验验证lnc5926 在胚胎发育中的作用；构建lncRNA5926 的过 表达载体，在细胞水平进行转录组测序，分析差异表达基因对胚胎发育的影响；检测 敲低和过表达lnc5926 后预测靶基因、细胞与胚胎测序重复差异表达基因和合子基因组 激活相关基因的表达水平；最后，在细胞水平检测组蛋白赖氨酸甲基化和乙酰化水平， 研究lnc5926 影响胚胎发育的机制。本研究获得如下结果： (1)lnc5926 在山羊早期胚胎发育过程中动态变化，符合合子基因组激活基因的表达 模式；下调lnc5926 水平显著降低囊胚发育率； (2) 通过 RACE 实验获得 lnc5926 基因全长，成功构建过表达载体 pcDNA3.1(+)-lnc5926 ，转染山羊胎儿成纤维(Goat fetal fibroblast, GFF)细胞，获得过表 达lnc5926 基因的细胞样品；细胞转录组测序共得到399 个差异表达基因，其中76 个 上调基因，323 个下调基因；与胚胎测序数据比对，在 8-细胞阶段和过表达细胞中都 上调的有2 个基因，都下调的有1 个； (3)通过敲低和过表达实验，证明lnc5926 对合子基因组激活基因Zscan4 和Eif1ax 具有重要调控功能； (4)利用免疫荧光染色实验和Western Blot 技术分析lnc5926 对细胞H3K9 三甲基化 (H3K9 me3)和H3K9 乙酰化(H3K9 Ac)水平的影响，结果表明过表达lnc5926 能够降低 胎儿成纤维细胞基因组H3K9 me3 的水平，提高基因组H3K9 Ac 的水平。 I 西北农林科技大学硕士学位论文 综上所述，lncRNA 是山羊基因组中的重要成分，能够影响合子基因组激活相关基 因的表达水平和胚胎发育率，并且可能改变组蛋白甲基化和乙酰化修饰水平，证明 lnc5926 对山羊早期胚胎发育有重要作用。这一研究发现为探索lncRNA 对哺乳动物胚 胎发育的影响及作用机制提供新见解，为进一步探究胚胎发育的调控机制奠定基础。 关键词：山羊；长链非编码RNA ；胚胎发育；合子基因组激活；组蛋白修饰 II 目录 目录 摘要I ABSTRACT III 目录 V 第一章 文献综述 1 1.1 LncRNA 的研究进展 1 1.1.1 LncRNA 概述 1 1.1.2 LncRNA 与细胞分化和个体发育 2