瘤胃亚硝酸盐依赖型甲烷氧化菌的检测与利用.pdf

摘 要 摘 要 反刍动物瘤胃产生的甲烷不仅加剧温室效应，而且浪费了 2%～15%的饲料总能。 研究显示，在日粮中添加硝酸盐能有效降低瘤胃甲烷排放。硝酸盐不仅可与产甲烷菌 竞争还原氢而显著降低甲烷的产量，而且为反刍动物提供非蛋白氮。但添加硝酸盐易 造成反刍动物瘤胃及机体亚硝酸盐中毒，目前还没有解决这一问题的有效措施。研究 发现，在淡水淤泥等环境中存在亚硝酸盐依赖型甲烷氧化菌（NC10 门细菌），这类菌 一方面可以利用甲烷，另一方面可以将亚硝酸盐还原。在前期工作中，我们发现反刍 动物瘤胃液中存在 NC10 门细菌，但在以甲烷为唯一碳源，硝酸盐为电子受体的富集 过程中并未检测到 NC10 门细菌，预示瘤胃中可能存在其他类型能更有效利用甲烷和 亚硝酸盐的厌氧甲烷氧化菌。 试验一 瘤胃液亚硝酸盐依赖型甲烷氧化菌多样性研究 为了检测瘤胃液中能够进行亚硝酸盐依赖厌氧甲烷氧化 （N-DAMO ）代谢的微生 物，本试验建立了以奶山羊瘤胃液接种物、甲烷为唯一碳源、亚硝酸钠为电子受体的 富集培养体系，并用16S rDNA 高通量测序方法检测瘤胃液和富集培养物中的微生物结 构及多样性。结果显示，经过 6 个月的富集培养，抑制了拟杆菌门和厚壁菌门的细菌 生长，促进变形菌门和放线菌门的细菌增殖，且变形菌门成为N-DAMO 富集培养系统 中的最主要的菌门，铜绿假单胞菌成为优势菌种。 试验二 铜绿假单胞菌NWAFUP1 分离鉴定及功能验证 在试验一的基础上，通过传统的分离纯培养技术分离培养富集培养体系中的优势 单菌株。形态学和分子生物学鉴定显示，被分离的菌株为N-DAMO 富集培养体系中的 优势OTU，即铜绿假单胞菌，并将其命名为铜绿假单胞菌NWAFUP 1。随后将其接种 13 15 到含有CH 和4 mM KNO 或2 mM NaNO 的厌氧环境中，采用同位素（ CH 、K NO 、 4 3 2 4 3 15 Na NO ）示踪技术检测其是否能够进行厌氧甲烷氧化。并在培养初期加入2% O 或添 2 2 加40 mM 乙酸盐-10 mM 丙酸盐，以探究氧气与其它碳源对铜绿假单胞菌NWAFUP1 的DAMO 功能影响。结果表明，铜绿假单胞菌NWAFUP1 可以独立完成反硝化型厌氧 甲烷氧化(DAMO)过程（P 0.05 ）。2%O2 和乙酸盐-丙酸盐对铜绿假单胞菌 NWAFUP1 的DAMO 功能有不同程度的影响，但并不会导致其DAMO 功能的消失。 试验三 体外添加铜绿假单胞菌NWAFUP1、硝酸盐对瘤胃发酵的影响 试验分别添加10 mmol/L KNO 、铜绿假单胞菌NWAFUP1 以及两者共同添加，以 3 研究体外添加铜绿假单胞菌NWAFUP1 对补充硝酸盐导致的瘤胃亚硝酸盐蓄积、发酵 性能及甲烷排放的影响。结果表明，添加铜绿假单胞菌NWAFUP1 可显著减少甲烷排 放（P 0.05 ），与单独添加硝酸盐相比，两者共同添加可显著提高中性洗涤纤维降解 I 西北农林科技大学硕士学位论文 率、酸性洗涤纤维降解率、异丁酸浓度、异戊酸浓度和发酵效率（P 0.05 ），显著降 低氨态氮浓度（P 0.05 ），缓解由于添加硝酸盐而导致的亚硝酸盐蓄积和丙酸合成抑 制（P 0.1 ）问题。 综上所述，在以甲烷为唯一碳源，亚硝酸盐为电子受体的瘤胃富集培养体系中， 优势OTU 为铜绿假单胞菌，其可以利用甲烷为唯一碳源，硝酸盐或亚硝酸盐为电子受