完整word版,Westernblot一、实验目的western技术是用来检测蛋白表达的特定的.docx

Wester n blot 实验目的 western技术是用来检测蛋白表达的特定的灵敏的方法。 原理 与Southern或Northern杂交方法类似，但 Western Blot采用的是聚丙烯酰胺 凝胶电泳，被检测物是蛋白质，探针”是抗体，显色”用标记的二抗。经过PAGE 分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以 非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。 以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或 同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的 特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。 三、操作步骤 （一）样品处理 1 培养的细胞： ⑴ 去培养液后用温的 PBS 冲洗 2~3 遍（冷的 PBS 有可能使细胞脱落） 。 ⑵ 加入适量的冰预冷的裂解液后置于冰上 10~20min。 ⑶ 用细胞刮刮下细胞，收集在 EP 管后超声（ 100~200w）3s，2 次。 ⑷ 12000g离心，4°C, 2min。 ⑸ 取少量上清进行定量。 ⑹ 将所有蛋白样品调至等浓度，充分混合沉淀后加 loading buffer 后直接上样最好， 剩余溶液（溶于IXoading buffer）可以低温储存，-70C—个月，-20C—周，4C 1~2 天，每次上样前 98C， 3min。 或收取细胞于EP管中加入适量的1XSDS，吹匀，100度5mi n,重复一次。 1200rpm ,10min.取上清定量。 3．组织： ⑴ 匀浆 对于心肝脾肾等组织可每 50~100mg加1ml裂解液，肺100~200mg加1ml 裂解液。可手动或电动匀浆。注意尽量保持低温，快速匀浆。 ⑵ 12000g 离心， 4C， 2min。 ⑶ 取少量上清进行定量。 ⑷ 将所有蛋白样品调至等浓度，充分混合沉淀加 loading buffer 后直接上样最好，剩 余溶液（溶于1 xloading buffer）可以低温储存，-70C—个月，-20C一周，4C 1~2天， 每次上样前 98C， 3min。 由于蛋白酶抑制剂可影响蛋白定量，且新鲜蛋白很少降解，故可不加，如加按建议比 例即可。提取磷酸化的蛋白还需加 Na3VO4 0.1mM 及 NaF 25mM）。 1Xoading buffer 配方：10% 甘油，50mM Tris Cl （pH6.8），2% 禺巯基乙醇，0.2~0.5 %。 溴酚蓝，2%或5%的SDS。Buffer可配成2X~5X，注意SDS终浓度勿超过10%。 对于心脏，肌肉等碎屑较多的组织可用 5%的SDS，肝肾等组织2%即可。） 二）配胶 注意一定要将玻璃板洗净， 最后用 ddH2O 冲洗，将与胶接触的一面向下倾斜置于 干净的纸巾晾干。 分离胶及浓缩胶均可事先配好 （除 AP 及 TEMED 外），过滤后作为储存液避光存放 于4C,可至少存放1个月，临用前取出室温平衡加入 10%AP及TEMED. 封胶： 灌入2/3的分离胶后应立即封胶，胶浓度V 10%时可用0.1%的SDS 封,浓度〉10% 时用水饱和的异丁醇或异戊醇，也可以用 0.1%的SDS。封胶后切记，勿动。本实 验室一般用水或异丙醇封胶。 待胶凝后将封胶液倒掉，如用醇封胶需用大量清水及 ddH2O 冲洗干净，然后加少 量0.1%的SDS，目的是通过降低张力清除残留水滴。片刻后倒掉 SDS，将玻璃板 倒立放置片刻控净。 封好浓缩胶后1h拔除梳子，注意在拔除梳子时宜边加水边拔，以免有气泡进入梳 孔使梳孔变形。拨出梳子后用 ddH2O 冲洗胶孔两遍以去除残胶即可上样，长时间 有利于胶结构的形成，因为肉眼观的胶凝时其内部分子的排列尚未完成。 （10%的AP最好现配现用，如在4 C存放勿超过两周。30%的丙烯酰胺如有沉淀， 最好弃掉 .） 各种分离胶 备种纽份名称 各冲武胶休积所对问的各冲沏。的取柑示 5nil 10ml lSiul 201111 h3o 2 6 5 3 7 9 LC 6 $0° ^Aciylan'JcU 1 2 ■H 4 1 5MTns-H^l(pHS.S) 13 2S 5.S 5.0 LD%SDS 0.05 0 10 C.15 0..20 L0%AP 0.05 0 10 匸15 0.20 TEMED 0 004 0 43 0012 0 016 8*!6Gel H;O 2.3 4￡ 59 X ?0ojAtn'iaiiJck 13 2.7 4 5 q L 5V Tn|?-H4?l(pH S.fi) 13 5 & 5 0 IO%SDS 0 05 0 IC r： 1> 0 20 109oAP 0”05 0 10 (■J5 0JO TEMED 0.003 0.0