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免疫组化操作步骤 第一节 免疫组化操作步骤及抗原修复（供参考） 第二节 免疫组化抗原热修复的技术要点（供参考） （一）、仪器设备 1. 18cm 不锈钢高压锅或电炉或用微波炉 . 2. 水浴锅 （二）、试 剂 1. PBS 缓冲液（ pH7.2 ― 7.4） 2 ．0.01mol/L 柠檬酸钠缓冲液（ CB,pH6.0,1000ml ） 3. 3% 甲醇 ―H 2O2 溶液：用 30%H 2O2 和 80% 甲醇溶液配制 4. 风裱剂： a. 甘油和 0.5mmol/L 碳酸盐缓冲液（ pH9.0 –9.5）等量混合 b 油和 TBS(PBS) 配制 5 ．TBS/PBS pH9.0 –9.5,适用于荧光纤维镜标本 ;pH7.0-7.4 适合光学纤维标本 （三）、操作流程 1、脱蜡和水化：脱蜡前应将组织芯片在室温中放置 60 分钟或 60 ℃恒温箱中烘烤 20 分钟。 a 组织芯片置于二甲苯中浸泡 10 分钟 ,更换二甲苯后在浸泡 10 分钟 b 无水乙醇中浸泡五分钟 c 95% 乙醇中浸泡五分钟 d 75% 乙醇中浸泡五分钟 2 、抗原修复：用于福尔马林固定的石蜡包埋组织芯片： 抗 原 修 复（免疫组化石蜡切片） 用于福尔马林固定的石蜡包埋组织芯片需要抗原修复 福尔马林固定的组织有可能破坏了原来组织的抗原结构， 蛋白多肽发生交联， 导致部分抗原表 位封闭，结合位点减少，所以需要抗原修复，以暴露原来的抗原表位，达到充分显露抗原，以不 出现明显脱片现象为佳。 抗原修复的几种常用方法（供参考） 1. 微波炉加热：在微波炉里加热 0.01 枸橼酸钠缓冲液（ pH6.0 ）至沸腾后将组织芯片放入，断 电，间隔 5-10 分钟，反复 1-2 次。根据玻片情况可参考采用微波加热 “3-5-3 法 ”3分钟温火沸腾 后静止 5 分钟，再温火沸腾 3 分钟即可。 适用的抗原：来源于人、大鼠、小鼠的组织标本；来源于其他动物种属的组织标本： 2. 沸热修复： 电炉或水浴锅加热 0.01M 枸橼酸钠缓冲液（ pH6.0 ）至 95 ℃左右，放入组织芯 片加热 10-15 分钟。 3. 高压热修复：在沸水中加入 EDTA(pH8.0) 或 0.01m 枸橼酸钠缓冲溶液（ pH6.0 ） .盖上不锈 钢锅盖，但不能锁定。将玻片置于金属染色架上，缓慢加压，使玻片在缓冲液中浸泡五分钟，然 后将盖子锁定，小阀门将会升起来。 10 分钟后除去热源，置入凉水中，当小阀门沉下去后打开 盖子。 此方法适用于较难检测或核抗原的抗原修复。 （骨及软骨组织的标本最好选择较温和的微 波加热修复） 4. 酶消化方法： 常用 0.1% 胰蛋白酶和 0.4% 胃蛋白酶液。胰蛋白酶使用前预热 37 ℃，消化时间约为 5-30 分钟。 适用于被固定遮蔽的抗原： 包括 Collagen.GFAP. Complement.Cytokeratin.c-erB-2.LCA.LN. 等 石蜡切片免疫组化染色步骤 1. 三步法（以 SP 试剂盒为例） ●石蜡切片脱蜡至水。 ●蒸馏水冲洗， PBS 浸泡 5 分钟，如果采用抗原修复，可在此步后进行。 ● 3%H2O2室温孵育 5~10 分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性， PBS 冲洗， 2 分钟 ×3 次。 ● 5~10%正常山羊血清封闭，室温孵育 10 分钟。倾去血清，勿洗，滴加适当比例稀释的一抗或一 抗工作液， 37 ℃孵育 1~2 小时或 4℃过夜。 ● PBS冲洗， 2 分钟 ×3 次。 ●滴加适当比例稀释的生物素标记二抗（ 1%BSA-PBS 稀释）， 37 ℃孵育 10~30 分钟；或滴加第 二代生物素标记二抗工作