反向斑点杂交.docVIP

核酸杂交技术根据检测目的和检测手段的不同，可分为液相杂交、固相杂交及细胞内定位 (原位 )杂交。固相杂交又可分为斑点杂交、凝胶电泳印迹转移杂交。而反向斑点杂交 (reverrsedotblot ，RDB)是 Saiki 等提出的一种斑点杂交技术，该技术较正向斑点杂交和凝胶电泳印迹转移杂交具有快速、简便、高敏感性、特意性强的特点，尤其是基因分型、基因突变检测，病原体的检测等方面有其独特的优势。 1 检测原理 反向斑点杂交工作原理，利用生物素等标记的探针和特意性扩增 PCR产物 (靶 DNA 序列 )杂交。但是不同于一般的斑点杂交。一般的点印迹杂交是靶 DNA 固定于硝酸纤维素膜或尼龙膜上，标记的探针和靶 DNA 杂交显色。这种方法每次杂交反映只能判断待测 DNA 是否含有某一种探针的同源序列，对于某些基因座位可能含有十几至几十个等位基因 (如 HLADRB位点或地中海贫血突变基因 )，用这种点杂交方法就会很繁杂，甚至可能做不到。 RDB正是解决了这一难题。 RDB是先将待用的探针分别点到硝酸纤维素 膜或尼龙膜上，每个探针一个点并编上号，再将待测的DNA 样本 (一般是经 PCR 特意性扩增的产物，在 PCR引物 5’端预先进行生物素标记，使扩增产物相应标记有生物素 )与之杂交，这样待检样本就会与具有同源序列的探针结合，经洗涤去除未结合的 DNA 样本，由于待测的 DNA 样本具有生物素类的标记物，结合了待测 DNA 的探针点上就带有生物素类的标记物，再经相应的显色反应就能显出杂交信号。这样一次就可以判断某一基因座位的大部分或全部等位基因，因此 利用这样的工作原理还可以用于基因分型、病原体检测、肿瘤研究等。 2 RDB检测 RDB是将多种探针固定在同一膜上，同时参与检测的样品 DNA 又互不干扰，故能一次性筛查出多种不同的序列，而不是像传统的杂交法，一次仅能检 测一个未知序列。同一条膜上的多种探针同时与不同扩增的 PCR产物进行杂交，并要求所有结合于膜上的探针应有大约相同的 Tm 值。因此尽可能使设计的探针 Tm 值变动在较小范围内。降低了假阳性率和假阴性率。本法操作安全、简 单、快捷，膜条植被时间较短，只需几小时，可大量预先制备放于 4℃保存待 1 / 4 用。 PCR扩增产物目的片段后，仅需杂交、洗膜 (实现了洗膜条件同一化，无需不同洗膜条件 )、显色、结果判定。应用凯普 HybrimaxDNA快速杂交仪使整个杂交过程在 1.5 h 即可完成。既适用于少量标本的分型检测，也可适用于大量标本的同时分型，具有敏感性高、特异性强、稳定性好的特点。 应用范围 由于 RDB具有高灵敏性、高特异性和准确性好的特点，目前该项技术已被用于病原体、肿瘤基因检测、病毒基因分型、基因突变以及多态性的研究等多个领域。 3.1 病原体检测 应用 RDB可以检出 10 ng 的细菌 DNA，如对肺炎链球菌检出率高、敏感性和特异性都很好［ 1］。 RDB可用来鉴定临床常见的 8 种医学真菌［ 2］。对沙眼衣原体，在不能得到血清型抗体或者不能进行衣原体培养的情况下来检测标 本中存在的衣原体血清型，应用 RDB对衣原体检测是一项简便而有效的技术［3］。 3.2 基因分型检测 国内外常用的基因分型方法包括： 限制性片段长度多态性 (RFLP)；序列特异性寡核苷酸探针 (PCRSSOP)；序列特异性引物 (PCRSSP)；单链构象多态性 (PCRSSCP)；序列测定 (DNASeguence)。这些方法各有其优缺点。主要缺点是包括技术复杂、成本昂贵、效率低及分辨率不足。而 RDB却较上述方法显示了其优越性，有广泛的应用价值。 3.2.1 RDB应用于人类白细胞抗原的分型 检测 HLA分子的多态性对于移植配型和科研有十分重要的意义［ 4］。 3.2.2 用于人类乳头瘤病毒 (HPV)的基因分型 2 / 4 HPV是已知少数 DNA 肿瘤病毒之一，在女性下生殖道肿瘤的检出率达到了90％，文献报告有 80 种左右的基因型， DNA 的检测和分型对女性生殖道肿瘤的病因学和癌情预报具有重要意义。齐风菊等［ 5］人应用 RDB用语 HPV常见不同型别的检测，使基因诊断程序大为简化，突现了对 HPV的快速诊断。 3.2.3 RDB用于丙型肝炎病毒 (HCV)分型 目前 HCV主要被划分为 6 种基因型。我国主要 HCV基因型为 1、2、6 型，其分布呈南北地域差异，南方以 1b 型为主，北方以 2a 型逐步增多，香港有 6 种。 HCV基因型无论是对 HCV的基础研究、临床治疗还是预 防，都有着重要意义。已知 HCV可分为 11 个基因性， 80 多个基因亚基， HCV 基因分型，唯一的参比标准是 HCV基因组测序。 RDB技术最大的特点就是简便、快速而分辨能力高，