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血液样品进色谱柱前去蛋白处理 2009年01月02日 20:40:15 作者： 液色迷人 引用 yao 的 血液样品进色谱柱前去蛋白处理 液色迷人 ? 血液样品进色谱柱前去蛋白处理 最近在做一个药物生物等效性实验,由于我是搞药化的,对这方面不了解,我想知道血液样品进色谱柱前去蛋白处理的方法有那些,他们之间的优缺点,对药物是否有影响,请那位前辈高手指点一哈的 不是高手，说说我们试验的处理：去蛋白处理目的：使结合的药物释放出来；避免提取时带入杂质和发生乳化；避免使色谱柱测试条件改变，如堵塞柱子等；去蛋白方法：一是使用蛋白沉淀剂三氯醋酸，高氯酸等，一是用有机溶剂如甲醇，乙腈，乙酸乙酯等，加入2-4倍体积。我们一般在样品中加甲醇（4倍体积），离心，取上清，加乙酸乙酯，蜗旋混匀，分层，取上清，再提一次，合并，氮气挥干。 可以看看这个具体的处理规范，应该会有收获血液样品预处理的标准操作 规范高效液相色谱分析中血液样品预处理的操作。1. 实验仪器与设备的预备1.1 试管 一般采用有盖子和刻度的尖底试管，要求密封性好，编号清楚准确，并摆放整洁。1.2 EP管 一般采用的规格有1ml、1.5ml、2 ml。要求密封性好，编号清楚准确，并摆放整洁。1.3 移液器 要求定量准确，重复性好。1.4 其它 涡流混合器、离心机、真空泵、烧杯、量筒、记号笔、试管架、标签纸等。 2. 样品的均匀化 2.1 将装有血浆（血清）样品的EP管放置在冰箱冷藏室内，缓慢解冻为血浆（血清）溶液。2.2 然后取出放置至室温，置涡流混合器上混匀或往复振摇亦可到达均匀的目的。3. 液－液提取 3.1 提取溶剂的预备 3.1.1 常用的溶剂有氯仿，二氯甲烷，乙酸乙酯，乙醚等。3.1.2 提取溶剂可以是一种也可以是几种溶剂的混合溶液，目的是调整提取溶液的极性，既保证待测样品被充分萃取进入提取溶剂，同时又有很好的选择性。（具体选择要根据药物性质而变化）3.2 根据待测样品的需要用移液器定量吸取血浆（血清）至试管中，盖好试管塞。3.3 必要时调整血浆（血清）溶液的pH值，根据待测样品的性质加入酸、碱或缓冲溶液。3.4 用移液器定量吸取提取溶液至装有血浆（血清）的试管中，盖好试管塞。3.5 溶液的混匀 3.5.1涡流混匀 将试管置于涡流混合器上进行旋涡，并保证样品溶液旋涡充分混匀，旋涡时间一般为2-3分钟。3.5.2 摇床混匀 将试管置于摇床上往复振摇，振摇时间一般为5-10分钟。3.6 样品的离心 将试管置于离心机中，分离过程中一般采用3000-4000r/min。离心之前注重要平衡，加速时应注重缓慢逐步加速，以防加速过快试管炸裂，离心时间一般为15-20分钟。3.7 离心分离后试管中样品分为上下两层，用移液器吸取上层有机相，转移至另一试管中。3.8 溶剂的挥发 经过以上处理后得到的样品溶液，假如待测物的浓度在定量限以上，而且溶剂对HPLC系统没有干扰，就可以直接进样分析。但是在很多情况下需要除去溶剂，即浓缩甚至干燥样品。除溶剂时最重要的是不丢失或破坏待分析物质，同时还要考虑安全性和经济等。3.8.1 自然挥发 将样品溶液放置在室温下挥发，有时还可适当加热，加速溶液挥发。3.8.2 氮气吹干 氮气流能防止发生氧化，为了加快挥散速度，将样品溶液置于氮气流下吹干。3.8.3 减压蒸发 在密闭容器内，通过抽真空以降低液体表面的压力，使其沸点降低，样品溶液很快挥发，减少了蒸发过程中样品与空气的接触，避免由此引起的分解等副反应，适于热不稳定的样品。3.9 样品的复溶 用于样品溶液残渣复溶的溶液通常采用流动相或其它有机溶剂。用移液器准确定量吸取，并且复溶样品应充分混合均匀。3.10 预处理样品的储存 预处理后的样品应保存在冰箱冷藏室，样品应竖直放置、排列整洁、编号准确清楚。待样品进样分析以前取出，以保证样品的稳定。3.11 乳化现象3.11.1防止乳化 可增加有机溶剂的体积，避免猛烈振摇或加入适当的试剂改变其表面张力等方法防止乳化。3.11.2 破乳 若已发生严重的乳化现象，应采取适当的方法消除乳化。3.11.2.1 离心 可将试管置于离心机中离心消除乳化。3.11.2.2 冷冻 可将试管置于冰箱中冷冻消除乳化。3.11.2.3 加入电解质。3.11.2.4 加入适当的稀释液稀释。4. 去蛋白处理 4.1 有机溶剂的预备 甲醇与乙腈是反相液相色谱法中常用的蛋白沉淀剂，因为它们与流动相的组成相同。甲醇沉淀蛋白的优点是上清液清亮，沉淀为絮状易于分离；乙腈与之相反，产生细的蛋白沉淀，但沉淀效率较甲醇高。4.2 根据待测样品的需要用移液器定量吸取血浆（血清）至试管中，盖好试管塞。text4