改造大肠杆菌生物合成N末端乙酰化多肽.doc

N-末端乙酰化胸腺素的生物合成技术 方宏清 一些天然多肽类药物，如胸腺素 α1（ Tα1）和胸腺素 β4（Tβ4）都具有 N-末端乙酰化修饰。由于目前现有生物合成技术难以实现多肽 /蛋白质的乙酰化修饰， 目前国内外均采用化学合成方法生产具有乙酰化修饰的 Tα1和Tβ4。 Tα1是具有 N-末端乙酰化修饰的 28肽，是一种生物反应调节因子， 作为 T淋巴系统的免疫增强剂，化学合成的 Tα1（商品名为日达仙），已上市销售多年，主要用肿瘤及肝炎等的辅助治疗，在国内市场有近十亿元的市场。由于化学合成成本等因 素，价格昂贵，进口每支（ 1.6mg） 700元，国产每支 120元，大多数病人花费不起。 Tβ4是一个具有 N-末端乙酰化修饰的 43肽。 Tβ4具有促进愈合伤口和抗炎作用。 目前化学合成的 Tβ4在临床试验中开展的研究有干眼症、神经损伤、心肌损伤等。 由于化学合成成本高，制备过程质量监控指标多，用基因工程方法制备胸腺素更具吸引力。蛋白质的 N-末端乙酰化修饰是由 N-末端乙酰转移酶（ N-terminal acetyltransferases，NATs ）将乙酰辅酶 A 的乙酰基团转移到蛋白质氨基末端的 α-氨基 上。细胞内存在多种 N-末端乙酰转移酶，分别负责不同类型氨基酸序列多肽的乙酰化修饰。我们利用基因组修饰技术将一种可以修饰 Tα1和Tβ4的 NAT 酶基因整合到大肠杆菌中染色体上获得整合型稳定表达。另一方面，为了高效制备小分子多肽，我 们将胸腺素与蛋白质内含肽融合表达， 然后通过诱导切割获得了胸腺素 （图 1）。通 过工程菌高密度培养、产物分离及切割、高效纯化，每升培养液可以获得 200mg的胸腺素纯品， 所制备产品具有均一的乙酰化修饰 （见图 2和图 3）。与化学合成相比，本方法将具有成本优势和环保优势，可替代化学合成方法。本技术已申请中国发明专利两项，均已授权（专利号： ZL 200910077750.8 ，ZL 201010521842.3 ） 。 本发明主要创新点（参见图示）： 1、改造大肠杆菌基因组使其可条件控制表达特异性 N- 末端乙酰转移酶，从而 可在需要时对目的多肽进行乙酰化修饰。 2、构建了一种新型融合表达载体， 将胸腺素基因与一种低分子量内含肽基因融 合表达，产物可进行自切割获得具有乙酰化修饰的胸腺素。 3、该技术可以替代现有化学合成方法大规模生产在临床上广泛应用的治疗药 物，降低生产成本。 、应用该方法制备的产品可以用于治疗肝炎、肿瘤、神经损伤、干眼症等。 图 1 乙酰化胸腺素生物合成技术路线图