名师醋酸纤维薄膜电泳法分离血清蛋白.docx

醋酸纤维薄膜电泳法分离血清蛋白 目的和要求 掌握醋酸纤维薄膜电泳的原理及操作方法 原理 带电质点在电场中向着反向电极移动的现象称为 电泳，其移动方向及速度取 决于本身所带电荷的性质和数量、电场强度以及溶液 pH 等因素。蛋白质分子在 溶液中的电泳是因其分子具有一些游离的 可解离基团 如 -COOH、-NH 2、-OH 等， 因而在某种 pH 值溶液中蛋白质分子带有一定的电荷。混合蛋白样品中由于各蛋 白质的等电点不同，在同一 pH 溶液中所带的电荷性质及电荷数目不同，因此在 电场中各种蛋白质泳动的方向和速度也不同，从而使蛋白质混合样品得以分离。 血清中含有白蛋白、 α-球蛋白、 β-球蛋白和 γ-球蛋白等，其氨基酸组分、立 体构象、相对分子质量、等电点及形状等均有所不同。由下表可见，血清中 5 种蛋白质的等电点大多低于 pH7.0，在 pH8.6 的缓冲液中都电离成负离子 (羧基解 离 )，故在电场中均向阳极移动。 蛋白质种类 等电点 (pI) 相对分子量 ( Mr ) 清 /白蛋白 4.88 69 000 α1-球蛋白 5.06 200 000 α2-球蛋白 5.06 300 000 β-球蛋白 5.12 90 000~150 000 γ-球蛋白 6.85~7.50 156 000~300 000 在一定范围内， 蛋白质的含量与结合的染料量成正比， 故可将各蛋白质区带剪下，分别用 0.4 mol/L NaOH 溶液浸洗下来，通过比色法或将染色后的薄膜直接用光密度计扫描，以测定特定电泳区带的蛋白质相对含量。 本实验采用的醋酸纤维薄膜电泳法是以醋酸纤维薄膜为支持物。 醋酸纤维素 是将纤维素的羟基乙酰化后形成的纤维醋酸酯，将其溶于有机溶剂 (如丙酮、氯仿、乙酸乙酯等 )后于聚乙烯材料上涂成均匀的薄膜，待溶剂蒸发后即可。该膜具有均一的泡沫状结构，有强渗透性、其厚度约为 120 μm。 醋酸纤维薄膜电泳具有微量、快速、简便、分辨力高、对样品无拖尾和吸附现象等优点，目前已广泛应用于血清蛋白、血红蛋白、糖蛋白、脂蛋白、结合球蛋白和同工酶的分离及测定。 操作步骤 ㈠ 准备 醋酸纤维薄膜的润湿和选择： 将薄膜裁成 8×2cm 状，使其漂在缓冲液液面上 (若迅速湿润，整条薄膜一致而无白点，则表明薄膜质地均匀，可用于电泳实 验 )，然后用竹夹 /镊子轻轻地将薄膜完全浸入缓冲液中，待薄膜完全浸透后使用 (约 0.5h)。 制作电桥：将电泳缓冲液倒入电泳槽两边并用虹吸管平衡两边液面。 根据电泳槽的纵向尺寸， 剪裁尺寸合适的滤纸条。 取四层附着在电泳槽的支架上， 使其一端与支架的前沿对齐， 另一端则浸入电极槽的缓冲液内。 然后用缓冲液将滤纸全部润湿并驱除气泡，使滤纸紧贴在支架上，即为 “滤纸桥 ”。按照同样的方法，在另一个电极槽的支架上制作相同的 “滤纸桥 ”。它们的作用是联系醋酸纤维薄膜和两极缓冲液之间的中间 “桥梁 ”。 ㈡ 点样 取出浸透的薄膜， 夹在两层滤纸之间吸去多余的缓冲液， 然后平铺在玻璃板 上 (无光泽面朝上 )，用点样器蘸取适量血清 (约 2~3 μl) ，再“印”在薄膜的点样区 (距薄膜一端 1.5 cm 处)。血清应均匀分布，形成具有一定宽度、粗细匀称的直线。 点样切忌过量， 可事先在滤纸上练习以掌握点样技术， 这是获得具有清晰区带的电泳图谱的重要环节之一。 ㈢ 电泳 将点好样的薄膜 (无光泽面朝下 )两端紧贴在支架的滤纸桥上 (加血清端靠负 极 )，中部保持悬空平直。先平衡 10 min ，仔细检查电泳装置的线路是否正确，然后通电。打开电源开关，调节电流为 0.4~0.6 mA (薄膜每厘米宽 )，电压为每厘米长 10~12V。在电泳过程中，应注意控制电压和电流强度，防止过高偏低。待 电泳区带展开约 3~5 cm 时，关闭电源，一般通电时间为 60 min 左右。 ㈣ 染色 电泳结束后，关闭电源，立即取出薄膜，直接浸入染色液中， 染色 5~10 min。 然后用漂洗液漂洗至 背景无色 (约 3~5 次)。再浸于蒸馏水中或用滤纸吸干。 ㈤ 结果判断 一般经染色漂洗后，薄膜上可呈现 5 条区带，由正极端起，依次为清蛋白、α1球蛋白、 α2球蛋白、 β球蛋白、 γ球蛋白。 试剂和器材 试剂 新鲜血清 (制备时要无溶血现象 ) 巴比妥 - 巴比妥钠缓冲液 (pH8.6，0.075mol/L，离子强度 0.06)：称取巴比妥 1.66g 和巴比妥钠 12.76g，溶于少量蒸馏水后定容至 1,000mL。 染色液：称取氨基黑 10B 0.5g，加入蒸馏水 40 mL，甲醇 50 mL 和冰醋酸 10 mL，混匀，贮存于试剂瓶中。 漂洗液：取 95%乙醇 45 mL，冰醋酸 5 mL 和蒸馏水 50 mL，混匀。 器材 醋酸纤维