sop 色谱柱的使用及维护.docVIP

目的： 建立大家对色谱柱的认识，以及能更好的使用色谱柱，延长使用寿命。 简介： 色谱柱由柱管、压帽、卡套（密封环）、筛板（滤片）、接头、螺丝等组成。根据碳链长度不同分为C4柱，C8柱，C18柱，按色谱固定相分为正相和反相，反相色谱填料常是以硅胶为基础，表面键合有极性相对较弱的官能团的键合相。反相色谱所使用的流动相极性较强，通常为水，缓冲液与甲醇，已腈等混合物。样品流出色谱柱的顺序是极性较强组合最先被冲出，而极性弱的组份会在色谱柱上有更强的保留。常用的反相填料有C18(ODS)、C8(MOS)、C4(B)、C6H5(Phenyl)等。正相色谱用的固定相通常为硅胶(Silica)，以及其他具有极性官能团，如胺基团(NH2,APS)和氰基团(CN，CPS)的键合相填料。由于硅胶表面的硅羟基(SiOH)或其他团的极性较强，因此，分离的次序是依据样品中的各组份的极性大小，即极性强弱的组份最先被冲洗出色谱柱。正相色谱使用的流动相极性相对比固定相低，如：正乙烷(Hexane),氯仿(Chloroform),二氯甲烷(Methylene Chloride)等。 色谱是一种分离分析手段，分离是核心，对色谱柱的要求是柱效高、分离能力强，分析速度快等。重点讲适用性大反相色谱柱，C8和C18都是反相色谱柱的一种，适用于分析弱极性的物质，而C8在弱极性较强的一侧，C18在极性较弱的一侧。也就是说，C8适合分析弱极性物质里极性稍强的一类物质，C18适合分析弱极性物质里极性更弱的物质。这是他们极性上的差别，但是差别并不是特别明显，一般能用C8分析的物质，在C18上也能分离。 C8碳键短,会有助于对非极性吸附过强的样品的洗脱,随着碳链增长,会增加键合相的非极性作用的面积,对保留值和选择性都有一定影响,随烷基碳链的增长对溶质分离的选择性也会增强。因此C8就更适合分析大分子类的物质，比如一些球蛋白等，都用C8和缓冲盐洗脱剂来配合使用。相反，分子量较小的物质，经常用C18来进行分析和分离。不过对单一或简单组分C8和C18柱没有太大区别 如果遇到性质差别比较大的样品，也就是说比较容易分离的样品，C8比C18的效率高。 对于一些非常大的分子量的非极性物质，用C18由于强保留而使物质不能被正常的洗脱，而用C8柱子就很容易洗脱出来，而又有一些物质出峰过于靠前时用C8柱子很难实现分离，这时如果用C18柱子就有相对更好的分离效果啦。 通常，我们检测样品首先选用C18柱；如果样品的分子量较大，就选C8；如果分子量再大，就选C4。 色谱柱的使用： 新色谱柱拿到手，一般都会有色谱柱，检测证书，色谱柱使用说明书，都需要妥善保存，色谱柱说明书一般会介绍色谱柱的详细参数，pH值耐受范围，最高耐受温度等，检测证书上会显示色谱柱的柱效，拖尾等信息，新色谱柱最实验前需要不接检测器用100%的甲醇或乙腈冲洗半个小时， 排出色谱柱保存废液，注意观察压力变化，此时可以连接检测器，在使用20%乙腈缓冲1小时，在使用流动相平衡色谱柱。 注意事项：流动相pH值必须在色谱柱耐受范围内，柱温不得超过色谱柱最高耐受温度，流动相需过膜，样品前处理越严格越好。 色谱柱每日冲洗： 为了不使被测物质和杂质停留在色谱柱中，在每次的样品分析工作完成之后，都应及时地清洗色谱柱。每次分析实验完成后，可用20%乙腈冲洗色谱柱0.4ml/min的流速冲洗2个小时，如果需要长期保存色谱柱，再使用100%的乙腈或甲醇0.4ml/min的流速冲洗30min。色谱柱一旦拆卸下来就得拧好柱塞，以免色谱柱内液体挥发导致硅胶床干裂，对色谱柱造成不可逆损伤。 色谱柱堵住后的冲洗： 在使用过程中，因为流动相，样品或者人为原因，色谱柱可能会发生压力增高或者堵塞的情况，此时需要根据具体情况冲洗色谱柱。 色谱柱因为流动相中的无机盐堵住了，使用高比例水相，低比例有机相冲洗（比如10%甲醇，10%乙腈）。有的色谱柱可用纯水冲，有的不能，主要看是否是亲水性和疏水性，如不明白打电话问色谱柱客服。