elisa的检测原理及步骤整理.pdf

Elisa Kit 使用方法 检测原理: 本实验采用双抗体夹心ELISA 法。抗人IL-4 单抗包被于酶标板上，标本和标准 品中的IL-4 会 与单抗结合，游离的成分被洗去。加入生物素化的抗人IL-4 抗体 和辣根过氧化物酶标记的亲 和素。生物素与亲和素特异性结合；抗人IL-4 抗体 与结合在单抗上的人IL-4 结合而形成免疫 复合物，游离的成分被洗去。加入显 色底物，若反应孔中有IL-4 ，辣根过氧化物酶会使无色 的显色剂现蓝色，加终 止液变黄。在450nm 处测OD 值，IL-4 浓度与OD450 值之间呈正比，可 通过 绘制标准曲线求出标本中IL-4 的浓度。 试剂盒组成： 1．抗体预包被酶标板（8×12 或 8×6 ） 2 ．冻干标准品（2 / 1 支；0.5ng/支） 3 ．标准品和标本稀释液（橙盖瓶）（1 瓶；20ml/12ml ） 4 ．浓缩生物素化抗体（紫盖瓶）（1 支） 5 ．生物素化抗体稀释液（蓝盖瓶）（1 瓶；16ml/10ml） 6 ．浓缩酶结合物（棕盖瓶）（1 支） 7．酶结合物稀释液（紫盖瓶）（1 瓶；16ml/10ml） 8 ．浓缩洗涤液 20× （白盖瓶）（1 瓶；50ml/25ml ） 9 ．显色底物（TMB ）（棕盖瓶）（1 瓶；12ml/6ml） 10．反应终止液（红盖瓶）（1 瓶；12ml/6ml） 11．封板胶纸（6/3 张） 12．产品说明书（1 份） 标本收集: 1. 收集血液的试管应为一次性的无热原，无内毒素试管。 2. 血浆抗凝剂推荐使用EDTA。避免使用溶血，高血脂标本。 3. 标本应清澈透明，悬浮物应离心去除。 4. 标本收集后若不及时检测，请按一次使用量分装，冻存于-20℃，-70℃电冰 箱内，避免反复冻融，3-6 月内检测。 5. 如果您的样本中检测物浓度高于标准品最高值，请根据实际情况，做适当倍 数稀释(建 议做预实验，以确定稀释倍数)。 注意事项: 1. 试剂盒使用前请保存在2-8℃。复溶后的标准品应分装后，将其放在-20～-70℃ 贮存。 2. 浓缩生物素化抗体，浓缩酶结合物体积小，运输中颠簸和可能的倒置，会使 液体沾到管壁 或瓶盖。因此使用前请用手甩几下或1000 转/分离心1 分钟，以 使附着管壁或瓶盖的液体沉积到管底。取用前，请用移液器小心吹打4-5 次使溶 液混匀。 3. 从冰箱中取出的浓缩洗涤液可能有结晶,属于正常现象，微加热至40 ℃使结晶 完全溶解后 再配制洗涤液。（加热温度不要超过50℃）使用时洗涤液应为室温。 4. 若需要分次使用标准品应按照每一次用量分装，将其放在-20～-70℃贮存。 避免反复冻 融。 5. 不同批号的试剂盒组份不能混用（洗涤液和反应终止液除外）。 1 6. 充分轻微混匀对反应结果尤为重要，最好使用微量振荡器(使用最低频率)，如 无微量振荡器，可在反应前手工轻轻敲击酶标板框混匀。 7. 在试验中标准品和样本检测时建议作双孔检测。 8. 试验中所用的试管和吸头均为一次性使用，严禁在不同的液体之间混用！否 则将影响试 验结果。 9. 试验中请穿着试验服并带乳胶手套做好防护工作。特别是检测血液或者其他 体液标本时， 请按国家生物试验室安全防护条列执行。 检测前准备工作: 1. 请提前20 分钟从冰箱中取出试剂盒，以平衡至室温。 2. 将浓缩洗涤液用双蒸水稀释(1:20)。未用完的放回4 ℃。 3. 标准品: 加入标准品/标本稀释液0.5ml 至冻干标准品中，静置15 分钟，待其 充分溶解后，轻轻混匀(浓度为1000 pg/ml)。然后根据需要进行稀释。(建议标 准曲线使用以下浓度： 1000、500、250、125、62.5、31.25、15.6、0 pg/ml) 。 复溶标准品原液（1000 pg/ml）若未用完请分装后放入-20℃以下电冰箱内保存， 保存两个月。已稀释的标准品请废弃。 4. 生物素化抗体工作液：按当次试验所需要得用量，使用前20 分钟，以生物素 化抗体稀释液稀释浓缩生物素化抗体(1:30)成工作浓度。当日使用。若实验次数 过多导致生物素化 抗体量不足，可向我们公司单独购买生物素化抗体。（须提 供抗体批号） 5. 酶结合物工作液：按当次试验所需要得用量，使用前20 分钟，以酶结合物稀 释液稀释浓 缩酶结合物(1:30) 成工作浓度。当日使用。若实验次数过多导致浓 缩酶结合物量不足， 可向我们公司单独购买浓缩酶结合物。（须提供酶结合物