脑胶质瘤循环游离DNA基因突变检测技术的建立及其应用研究.pdf

摘要 摘要 胶质瘤是颅内最常见的肿瘤，它复发率高、病死率高、生存期短，是当今医学界 面临的共同难题。近年来，随着现代分子生物学和高通量基因测序技术的进一步发展 和广泛应用，人们对胶质瘤的基因组变化的认识更加全面，众多分子标志物的发现推 动了基于分子分型的胶质瘤个体化治疗的步伐。然而，目前的分子检测均依赖于来源 于颅内手术切除或穿刺活检的肿瘤组织。组织标本取材的局限性 （有创、风险高、不 能反复取材）以及分子异质性使得目前普遍存在于临床上根据特定部位的肿瘤组织标 本检测结果所制定的后续诊治方案受到质疑。循环肿瘤DNA 作为液体活检主要手段， 可实现非入侵的反复获取，及克服肿瘤异质性并能够实时监测肿瘤的变化情况，为解 决上述问题提供了方法和工具。但是体液 （血液或脑脊液）中的游离DNA 含量非常 少，且容易受到野生型模板信号的干扰，常见的检测手段不能准确的检测，需要灵敏 度更高的检测方法。 因此，围绕着开发灵敏准确的胶质瘤游离DNA 分子标志物检测技术这一目的， 本研究针对胶质瘤重要分子标志物IDH1 突变、TERT突变，基于芯片式数字PCR 技 术，建立了游离DNA 基因突变的数字PCR 检测方法。并利用本研究建立的数字PCR 检测方法，对101例脑胶质瘤患者配对的肿瘤组织、血液和脑脊液样本中IDH1 突变 和TERT启动子突变检测并对其情况进行了检测和分析。 本研究结果表明，建立的IDH1R132H 突变、TERT启动子突变的数字PCR 检 测方法可对野生型DNA 模板背景中低至0.01-0.1%的肿瘤基因突变进行检测，与荧光 PCR 技术相比，灵敏度均为100%，特异性在97.9%-100%之间，确认了所建立方法 的准确性和可靠性。对配对的肿瘤组织、血浆和脑脊液样本中IDH1 突变、TERT突 变检出的一致性进行了分析，发现脑脊液与肿瘤组织基因突变的符合率 （80%-90%） 明显高于血浆与肿瘤组织基因突变的符合率(70%-85%)，说明脑脊液游离DNA 的浓 度虽然低于肿瘤组织中游离DNA 的含量，但更能反映患者肿瘤组织基因组DNA 的 变化情况。对101例临床样本中IDH1 突变、TERT突变的分布特征进行了分析，发 现IDH1 突变主要常见于低级别胶质瘤中，TERT突变主要存在于高级别胶质瘤中， 69 IDH1 TERT IDH1 二者一般呈现出互相排斥的现象。分析了 例胶质瘤患者 、 启动子和 突变和TERT启动子与无进展生存期 （PFS）和总生存期 （OS）的关系。发现无论是 I 西北大学硕士专业学位论文 组织或血液样本中，IDH1R132H 突变均与PFS和OS延长显著相关，而TERT 突变 仅与PFS缩短显著相关，IDH 1和TERT 双突变组比仅有IDH1 突变组有更长的OS PFS 3 和 。对 患者不同治疗阶段的血液和脑脊液样本中肿瘤突变变化情况进行了实时 检测，发现血液中ctDNA 突变含量显著低于脑脊液，血液或脑脊液中IDH1或TERT 突变含量变化与患者的疾病进展和治疗效果呈负相关。 总之，本研究证实了基于数字PCR 技术的胶质瘤循环游离DNA 基因突变检测技 术在胶质瘤临床诊断和治疗中的有效性，同时也初步明确了血液和脑脊液ctDNA 分 子变异在临床患者预后和疗效评定方面的应用价值。 关键词：脑胶质瘤，循环游离DNA，IDH1基因，TERT基因，数字PCR II 缩略语对照表 缩略语对照表 缩略语 英文全称 中文全称 IDH1 Isocitratedehydrogenase 异柠檬酸脱氢酶1 ctDNA Circulatingtumo