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选修三专题训练 PCR 技术及习题 PCR （polymerase chain reaction ）：聚合酶链式反应 1、PCR 原理：在解旋酶作用下，打开DNA 双链，每条DNA 单链作为母链， 以4 中游离脱氧核苷酸为原料，合成子链，在引物作用下，DNA 聚合酶从引物 3端开始延伸DNA 链，即DNA 的合成方向是从子链的5端自3端延伸的。实际 上就是在体外模拟细胞内 DNA 的复制过程。DNA 的复制需要引物，其主要原 因是DNA 聚合酶只能从3 ′端延伸DNA 链。 2 、PCR 反应过程是：变性→复性→延伸 类似于DNA 的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引 物。 PCR 由变性--退火（复性）--延伸三个基本反应步骤构成： ①模板DNA 的变性：当温度上升到90 ℃以上时，双链DNA 解聚为单链，以便 它与引物结合，为下轮反应作准备； ②模板DNA 与引物的退火（复性）：温度下降到50℃左右，两种引物通过碱基 互补配对与两条单链DNA 结合； ③引物的延伸：72℃左右时，TaqDNA 聚合酶有最大活性，可使DNA 新链由5 端向3端延伸。 1 第 页 选修三专题训练 3、结果：上述三步反应完成后，一个DNA 分子就变成了两个DNA 分子，随着 重复次数的增多，DNA 分子就以 2n 的形式增加。PCR 的反应过程都是在PCR 扩增仪中完成的。 4 、细胞被DNA 复制与PCR 技术的比较： 细胞内DNA 复制 体外DNA 扩增（PCR ） 解旋 在解旋酶作用下边解旋边复制 80～100℃高温解旋，双链完全分开 不同酶 DNA 解旋酶、DNA 聚合酶 TaqDNA 聚合酶 点 引物 RNA DNA 、RNA 温度 体内温和条件 高温 ①需提供DNA 模板 相同点 ②四种脱氧核苷酸为原料 ③子链延伸的方向都是从5端到3端 2 第 页 选修三专题训练 知识点拨： 1、DNA 分子复制的人工控制 解开螺旋：在80～100℃时，DNA 双螺旋打开，形成两条DNA 单链，称为变性。 恢复螺旋：在50～60℃左右时，两条DNA 单链重新形成双螺旋结构，称为复性。 复制条件：缓冲液，DNA 模板、四种脱氧核苷酸、热稳定 DNA 聚合酶、两种 引物。 控制仪器：PCR 仪（温度周期性自动调节仪）。 2 、PCR 的含义是多聚酶链式反应。 3、PCR 技术反应的条件：①稳定的缓冲溶液环境 （一般使用 Tris-Cl 缓冲液， 标准的为 10mmol/L,并将其调节到8.3~8.8 之间）；②DNA 模板；③合成引物 （2 个）；④四种脱氧核甘酸；⑤DNA 聚合酶；⑥温控设备 4 、PCR 技术最突出的优点是快速、高效、灵活、易于操作。 5、TaqDNA 聚合酶的特点是：耐高温。 知识拓展： 1、DNA 聚合酶不能够从头合成DNA ，只能从DNA 的3端开始延伸DNA 链， 因此DNA 复制需要引物。 2 、引物: 引物是 PCR 特异性反应的关键，PCR 产物的特异性取决于引物与模 板DNA 互补的程度。理论上，只要知道任何一段模板DNA 序列，就能按其设 3 第 页 选修三专题训练 计互补的寡核苷酸链做引物，利用PCR 就可将模板DNA 在体外大量扩增。 3、PCR 引物设计原则： （1）PCR 引物通常长15-25 碱基，其中G＋C 约占50% 。 （2 ）引物之间不能互配形成双链结构，引物内部也不能形成发夹结构。 （3 ）引物的3’末端必须与目的片段完全相配。 （4 ）引物的5’末端可以不与目的片段互补，可以包含内切酶位点或启动子序列， 但在下一轮反