LFGB基础实验操作指南.docxVIP

PAGE PAGE # 目录 Parti: 鱼类肌肉组织DNA的提取 TOC \o 1-5 \h \z Part2 :组织RNA的提取、纯化及反转录 4 \o Current Document Part3 ： PCR 11 \o Current Document Part4 : DNA勺凝胶电泳 17 \o Current Document Part5 ：蛋白质电泳 22 \o Current Document Part6 ： RA CE 25 \o Current Document Part7 ：切胶回收、连接转化、菌落 PCR. 27 \o Current Document Part8 ：原位杂交探针合成 . 31 \o Current Document Part9 ：组织切片原位杂交（ ISH） 34 \o Current Document PartIO : HE染色 37 Part11 ：整体原位杂交 39 \o Current Document Part12 ：染色体制备 42 \o Current Document Part13 ：荧光原位杂交（ FISH） 44 Part1: 鱼类肌肉组织 DNA 勺提取 实验准备： 样品： 牙鲆或者半滑舌鳎肌肉组织 （活鱼解剖及取样见视频 ） ； 保存方式：-80C或梯度乙醇保存（95%-75%; 耗材： 枪头（最好减掉尖端头部部分），1.5mlEP管，50ml离心管; 仪器： 水浴锅，冷冻离心机，研钵 , 剪刀，镊子， 酒精喷壶； 试剂：液氮，TNES蛋白酶K,平衡酚，三氯甲烷，异戊醇，异丙醇，无水乙 醇，NaAc TE缓冲液,RNaseA; 试剂配制： 裂解缓冲液TNES 125mM NaC； 10mM Tris-HCl, pH 7.4 ； 10mM EDT；SDS 0.5% Urea 4M; 蛋白酶K 粉末溶解后分装于1.5ml EP管，工作浓度20mg/ml; 平衡酚(索莱宝) 作用：使蛋白质变性，同时抑制了 DNase的降解作用。用苯酚处理匀浆液时，由 于蛋白与DNA联结键已断，蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。 蛋白分子溶于酚相，而 DNA溶于水相。 优点： 有效变性蛋白质；抑制了 DNase的降解作用； 缺点： 酚与水相有一定程度的互溶，大约 10%?15%的水溶解在酚相中，因而损失了 这部分水相中的DNA不能完全抑制RNase的活性； 注意：使用后及时放回4C避光保存；溶液颜色变深，偏红时，酚已经被氧化， 失效，及时更换； 氯仿/异戊醇：体积比24:1 氯仿：克服酚的缺点；加速有机相与液相分层；酚易溶于氯仿中，因此最后用氯 仿抽提去除核酸溶液中的迹量酚； 异戊醇：减少晃动时产生的气泡。异戊醇可以降低表面张力，从而减少气泡产生。 另外，异戊醇有助于分相，使离心后的上层含DNA的水相、中间的变性蛋白相及 下层有机溶剂相维持稳定； 饱和 NaAc 3M, pH 5.2 300ml H2O + 122.472g NaAc ? 3H2O或 100ml H2O+24.609g NaAC 用 NaOH HAc调 pH. 1 X TE 缓冲液(pH 7.4 ) 10mmol/L Tris-Cl (pH 7.4 )，10mmol/L EDTA (pH 8.0) 实验步骤： 裂解 液氮研磨法：肌肉组织置于研钵中，加入液氮，仔细研磨成粉末状，越细越好， 将粉末分装于1.5mlEP管中，加到刻度线100ul处。加入550ul TNES 6ul蛋白 酶K,56 C水浴，直到裂解液澄清，若需过夜，将水浴锅调至 37C过夜； 机械剪碎法：取肌肉组织加入 550ul TNES 6ul蛋白酶K 56C水浴20-30min , 使用小剪刀将组织剪碎，尽可能细小，再 56 T水浴过夜，直至裂解液澄清； 抽提蛋白 加入1:1的平衡酚：氯仿/异戊醇（24:1 ）各300ul，轻轻晃动 20min，再 13000rpm/min， 20min； 溶液分层，上层为水相，含有 DNA下层为有机相；中间是蛋白层；使用剪过的 枪头小心的吸取上清，注意不要吸到蛋白层，加入 TE补足600ul。 重复上一步骤，直至水相和有机相之间无蛋白层； 去除残留酚 取上清，加入TE补足600ul，加入氯仿/异戊醇（24:1）600ul，轻轻晃动20min, 再 13000rpm/min， 10mi n； 重复上一步骤（可不选）； 沉淀DNA 取上清，加入异丙醇700ul ，饱和NaAc50ul，置于-20 C 3h，再4C, 13000rpm/min， 10mi n； 清洗沉淀 预冷的 70%乙醇 1ml 洗涤沉淀，4°C，1