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原子力显微镜纳米压痕技术用于评估纳米药物功效 随着纳米药物的发展，其在细胞内的靶向递送[1～3]、药物缓释[4～6]和改善药物相容性等方面显示出明显的优势。纳米药物是以纳米材料作为载体的药物，具有颗粒小、比表面积大、活性位点多、吸附性强等特点，通过高效的药物递送可延长药物半衰期，并减少药物对正常细胞的影响。近十几年来，评估纳米药物功效与细胞凋亡之间的关系一直是研究热点。目前，一些方法已用于纳米药物功效的检测，例如荧光素发光[9，10]、DNA凝胶电泳和流式细胞术。这些方法多通过测量药物治疗后细胞内生物大分子的变化，反映纳米药物的功效。Shen等利用流式细胞仪检测小鼠成纤维细胞中活性氧含量的变化反映铁-MIL-101-NH2纳米药物对细胞凋亡的影响。纳米药物作用后，受细胞骨架和功能蛋白影响的细胞力学性质会发生很大变化[14，15]，但是需要在生理条件下实时检测细胞力学性质的变化，才能更真实和确切地反映真实细胞中的情况。 已有研究者利用原子力显微镜（AFM）测量细胞膜的粗糙度，研究纳米药物功效[16，17]，而活体细胞膜成像的难度较大，一些细节变化难以检测。作为AFM重要应用的纳米压痕技术是测试材料力学性能最简单的方法之一，可实时检测活细胞的力学性质[18～20]。细胞在生长、分化、凋亡、癌变及与邻近细胞或细胞外基质相互作用时，细胞的内部结构和性质会产生明显的变化[21，22]。在多数情况下，由于细胞骨架结构和组织的改变，癌细胞（如膀胱癌、前列腺癌、甲状腺癌和卵巢癌[23-28]）比正常细胞具有更大的可变形性。实际上，细胞骨架密度的降低是肌动蛋白丝的部分缺失或微管紊乱的结果。基于AFM的纳米压痕技术可利用压电陶瓷控制灵敏的微悬臂接触细胞，在接触细胞膜后，保持垂直位置的恒定压力，通过记录AFM微悬臂的偏转，可检测到细胞骨架因药物作用而产生的细微的结构变化。细胞具有弹性，由微管和肌动蛋白支持，药物的作用可引起细胞凋亡，导致细胞骨架被破坏，从而降低细胞的杨氏模量。Zhang等利用AFM纳米压痕技术检测了西妥昔单抗的抗癌效果。作为广谱抗癌药物，阿霉素（DOX）和喜树碱（CPT）可用于制备脂质体纳米药物[32，33]，其药效评估尤为重要。 本研究通过分析不同浓度DOX和CPT脂质体纳米药物与细胞孵育不同时间后细胞的力学性能改变来评估纳米药物的功效。在不同条件下，经纳米药物处理后，测量了细胞的反馈力、压痕深度与杨氏模量; 同时，分析了与纳米药物共孵育不同时间后细胞的粘弹性，以评价纳米药物的功效。 2实验部分 2.1细胞培养 宫颈癌（HeLa）细胞由中国科学院上海干细胞库提供。细胞在DMEM培养基（Dulbecco Modified Eagle Hyclone）中，于37℃，5% CO2气氛中培养。将10%胎牛血清（FBS）、100 U/mL青霉素、200 U/mL链霉素和BIOMYC-3（以色列Biological Industries）抗生素溶液加入细胞培养基中。将具有高硬度的22 mm × 22 mm石英玻璃盖玻片加入到35 mm细胞培养皿中，获得约70%的细胞生长密度后，进行纳米压痕实验。实验前，用1000 mL磷酸盐缓冲液（PBS，8.0 g NaCl、3.4785 g Na2HPO4·12H2O、0.2 g KCl、0.2 g KH2PO4溶于1000 mL蒸馏水）清洗3次，用无血清的DMEM培养液再润洗一次，之后在培养皿中加入2 mL无血清的MEM培养液，进行纳米压痕实验。 2.2压痕实验 利用Agilent AFM 5500（美国Agilent Technologies公司）在37℃恒温加热台上进行纳米压痕实验。将直径约5 μm的聚苯乙烯微球粘到AFM探针微悬臂上（MSCT，A针，标定弹性常数为0.068 N/m）。以2 μm/s的速度进行力-压痕曲线测量，扫描范围2 μm。在纳米压痕实验过程中，探针接触细胞表面后，控制压电陶瓷继续运动1.3 μm，使微球充分接触细胞。微球尽量压在细胞核周围相对平坦区域内。每个实验条件进行3组独立实验，每组测试5个细胞，并收集约1000条力-压痕曲线，共15个细胞，约3000条力-压痕曲线。 2.3杨氏模量计算 依据文献报道的方法测算AFM探针微悬臂的弹性常数，根据胡克定律计算加载力： 其中，F0是加载力，k是带有微球的AFM探针微悬臂弹性常数，Δz是在纳米压痕测试过程中检测到的AFM探针微悬臂的Z轴方向的位移变化。杨氏模量通过赫兹模型计算获得，模型假设压痕区域较小时，该区域是连续且不可压缩的。研究证明，该模型可用于计算细胞弹性，计算方法见公式（2）： 其中，E是杨氏模量，是压痕深度，R是微球半径，v