血清(浆)清蛋白(alb)测定——溴甲酚绿(bcg)染料结合法.pptVIP

血清(浆)清蛋白(Alb)测定;肝脏在蛋白质代谢过程中起重要作用，血浆内主要的蛋白质几乎全部由肝脏制造。肝脏合成的蛋白质主要为清蛋白，大部分球蛋白也由肝脏产生。肝脏尚能合成酶蛋白和凝血因子，如纤维蛋白质，凝血酶原、Ⅴ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ 因子等。;清蛋白（albumin） 又称白蛋白。是一类不被50％饱和度的硫酸铵溶液沉淀的球状蛋白质。由肝实质细胞合成，在血浆中的半寿期约为15-19天，是血浆中含量最多的蛋白质，占血浆总蛋白的40%-60%，等电点4.9，是血浆中主要的载体，许多水溶性差的物质可以通过与清蛋白的结合而被运输。具有活性的激素或药物与清蛋白结合时，可以不表现其活性，而视为其储存形式，由于这种结合的可逆性和处于动态平衡，因此在调节这些激素和药物的代谢上，具有重要意义。;血清(浆)清蛋白(Alb)测定;血清蛋白测定主要包括总蛋白、清蛋白、球蛋白和白／球比值。其参考区间为：总蛋白 65－85g/L、清蛋白40－55g／L、球蛋白20－40g/L、白/球比值为1.2~2.4:1。清蛋白减少，白/球比值降低，甚至颠倒，是肝硬化的特征。但在代偿良好的肝硬化患者，即使已出现明显增高（球蛋白血症），清蛋白的减少也往往属轻度，而当肝硬化患者已届失代偿期时，清蛋白即明显减少。测定血清总蛋白及清蛋白浓度，可作为判定慢性肝病患者预后的良好指标。肝硬化病人如总蛋白低于60g/L，清蛋白低于30g/L，提示预后欠佳。;先加入50%不饱和硫酸铵使球蛋白沉淀，清蛋白留在溶液中，然后分别测定之。 此法操作复杂，温度、盐浓度等对结果均有影响，故被逐渐废弃。;将蛋白置于比其等电点高的pH缓冲液中，利用不同蛋白质所带负电荷不同而分离，然后染色测定。 易受清/球比值对染料结合力的干扰，且费时较多。;通过蛋白质特异的抗原、抗体反应标记上可见的显示物系统来检测蛋白质含量的方法。 特异性强、灵敏度高、定位准确和简便快速，但成本较高。;将蛋白置于比其等电点低的pH缓冲液中，则蛋白质为阳离子，与阴离子染料结合，然后比色检测蛋白质含量。 此法操作简便,灵敏度高,重复性好,适合自动分析;且球蛋白一般与阴离子染料不结合,无干扰作用。是清蛋白测定的常规方法，应用最广。 测定Alb常用的染料有甲基橙、溴甲酚紫(BCP)、溴甲酚绿（BCG）等，目前应用最广的是BCG。;在pH 4.2的缓冲液中，清蛋白分子带正电荷，在有非离子去垢剂（Brij-35）存在时，与带负电荷的溴甲酚绿(BCG)生成蓝绿色复合物，在628nm波长处有吸收峰，复合物的吸光度与清蛋白浓度成正比，与同样处理的清蛋白标准液比较，可求得血清清蛋白含量。;1. 血清（推荐），因为有纤维蛋白原和肝素存在时，会引起清蛋白测定结果偏高。 1．BCG试剂 (pH4.15±0.05) 2．总蛋白标准液 3．自动生化分析仪或722型分光光度计，刻度吸管，试管，试管架，微量加样器，恒温水浴箱等;按下表操作：;【参考区间】 成人：血清清蛋白：40～55g/L；球蛋白20～40g/L、白/球比值为1.2～2.4 : 1;1. BCG与蛋白质结合的特异性较低。它不仅与清蛋白呈色，而且与血清中多种蛋白成分呈色，其中以α1球蛋白、转铁蛋白、触珠蛋白更为显著。BCG与不同蛋白质的反应速率不同，与清蛋白可立即发生反应（快反应），与其它蛋白质反应较慢（慢反应）。实际上，当血清与BCG混合时，“慢反应”已经发生，不过实验证明，“慢反应”持续1h才完成。因此，当BCG与血清混合后，在30s读取吸光度，可明显减少非特异性结合反应。;2. 当60g/L清蛋白标准与BCG结合后，比色杯光径1.0cm，在628nm测定的吸光度应为0.811±0.035，如达不到该比值，表示灵敏度较差。 3. 试剂中的聚氧化乙烯月桂醚也可用其他表面活性剂代替，如吐温-20等，终浓度为2ml/L，灵敏度和线性范围不变。 4. 配制BCG试剂也可用其他缓冲液如枸橼酸盐或乳酸盐缓冲液。但琥珀酸盐缓冲液的校正曲线通过原点，线性好，灵敏度高，成为首选推荐配方。 5. BCG系一种pH指示剂，它受酸、碱影响较大，所用器材必须清洁，无酸、碱污染。;6. 高胆红素血症和溶血标本对本法不产生干扰。严重高脂血症可使结果偏高，应采用标本空白校正。若标本混浊，可做标本空白（血清0.02ml，加琥珀酸缓冲液4ml），用测定管吸光度减去标本空白管吸光度后再计算结果。 7. BCG试剂的pH必须严格控制在pH4.15±0.05，pH升高可使染料空白增高，与清蛋白结合率下降。所以，控制反应液的pH是本法测定的关键。 8. Brij-35是一种非离子去垢剂，它可增强BCG-清蛋白复合物的溶解度，消除BCG同清蛋白反应时可能产生的沉淀，它的浓度高于或低于所指定的浓度时，均导致敏感度降低和直线性丧失，对测定结果有较大影