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凝胶层析法分离标准蛋白 （1 ） 1 实验背景 层析技术（chromatography）  亦称色谱技术，是利用混合物中各组分的物理、化学、生物性 质的差别，使各组分以不同程度分布在两个相中（其中一个相 为固定的，称为固定相stationary phase ；另一个相则流过此固 定相，称为流动相mobile phase）并使各组分以不同速率随流动 相移动，从而达到分离各组分的效果  如离子交换层析、凝胶层析、亲和层析、疏水层析 1 实验背景 凝胶层析（gel chromatography）也称：  分子筛层析（molecular sieve chromatography ）  凝胶过滤层析 （gel filtration chromatography ）  凝胶排阻层析（gel exclusion chromatography ）  凝胶渗透层析（gel permeation chromatography ） 是按分子大小不同分离样品中各个组分的层析方法 1 实验背景 层析柱 洗脱液进口 洗脱液（流动相） 凝胶介质（固定相） 市售的层析柱 洗脱液出口 1 实验背景 凝胶层析的原理  凝胶颗粒内部具有多孔网状结构，被分离的混合物流过层析柱 时，比凝胶孔径大的分子不能进入凝胶孔内，在凝胶颗粒之间 的空隙向下移动，洗脱体积小，最先被洗脱出来；比网孔小的 分子能不同程度地自由出入凝胶孔内外，在柱内经过的路程较 长，洗脱体积大，最后被洗脱出来，由此达到分离 1 实验背景 外水体积V 内水体积V 基质体积V 柱体积V o i g t V ＝V ＋V ＋V t o i g 由于V 相对很小，可以忽略不计，则有： g V ＝V ＋V t o i 1 实验背景 溶质的洗脱体积Ve  某一样品的洗脱体积 V = V ＋K V e o d i  Kd ：分子量不同的溶质在凝胶内部和外部的分配系数，只与 被分离物质分子的大小和凝胶颗粒孔隙的大小分布有关，而 与柱的长短、粗细无关，也就是说它对每一物质为常数，与 柱的物理条件无关 1 实验背景 V - V e o K = d V i 如果求K ，需要知道V 、V 、V d i o e  Ve ：某溶质的洗脱体积  Vo ：外水体积，用带有颜色的大分子溶液，如分子量约 6 2 ×10 的蓝葡聚糖2000的洗脱体积  V ：内水体积，由g ×W 求得，g为干凝胶重，W 为凝胶 i R R 的吸水量