单克隆抗体制备中筛选杂交瘤细胞的原理[汇编].docxVIP

文档收拾 | 学习参阅 collection of questions and answers 20XX 单克隆抗体制备进程中挑选杂交瘤细胞的原理和办法 单克隆抗体制备进程中，有两次挑选进程，第一次是选出杂交瘤细胞（用挑选培育基），第2次是进一步选出能发生咱们需求的抗体的杂交瘤细胞。 第一次挑选的原理和办法： 细胞交融后，杂交瘤细胞的挑选性培育是第一次挑选的要害。遍及选用的HAT挑选性培育液是在一般的动物细胞培育液中家次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸腺嘧啶核苷酸。其一居室细胞中的DNA组成油两条途径： 一条途径是生物组成途径（“D途径”），即由氨基酸及其其他小分子化合物组成氨基酸，为DNA分子的组成供给质料。再此组成进程中，叶酸作为重要的辅酶参加这一进程，而HAT培育液中氨基蝶呤是一种叶酸的拮抗物，能够阻断DNA组成的D途径。 另一条途径是应急途径（“S途径”），她是使用次黄嘌呤——鸟嘌呤磷酸核苷转移酶和胸腺嘧啶核苷激酶催化次黄嘌呤和胸腺嘧啶生成相应的核苷酸，两种酶缺一不可。 因而，在HAT培育液中，未交融的效应B 细胞核两个效应B细胞交融的D途径被氨基蝶呤阻断，随S途径正常，但因缺少在体外培育液中增殖的才能，一般10天左右会逝世。关于骨髓瘤细胞以及本身交融细胞而言，因为一般选用的骨髓瘤细胞是次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核苷转移酶缺点型细胞，因而本身没有S途径，且D途径又被氨基蝶呤阻断，一切在HAT培育液中也不能增殖而很快逝世。只要骨髓瘤细胞与效应B细胞彼此交融构成的杂交瘤细胞，既具有效应B细胞的S途径，又具有骨髓瘤细胞在体外培育液中长期增殖的特性，因而能在HAT培育液中挑选性存活下来，并不断增殖。 第2次挑选的原理和办法： 在单克隆抗体的出产进程中，因为效应B细胞的特异性是不同的，经HAT培育液第一次挑选出的杂交瘤细胞发生的抗体存在差异，有必要对杂交瘤细胞进行第2次挑选，选出能发生特定抗体的杂交瘤细胞。二次挑选一般选用有限稀释克隆细胞的办法，将杂交瘤细胞多倍稀释，接种在多孔的细胞培育板上，是每孔细胞不超越一个，经过培育让其增殖，然后检测各孔上清液中的细胞排泄的抗体，上清液可与特定抗原结合的培育孔为阳性孔。阳性孔中的细胞还不能确保是来自单个细胞，继续进行有限稀释，一般重复3-4次，直至坚信每孔中增殖的细胞为单克隆细胞。第2次挑选也是判定的进程。