菌种鉴 定方法.doc

抗酸染色法 抗酸染色法acid—ｆast staining methoｄ 1８８2年由埃利希(F、Ehrlicｈ)首创并经Ｆ、齐尔(Zｉehｌ)改进而创造出得细菌染色法。 简介 其中最具代表性得为对结核菌得齐尔—尼尔森(Zｉeｈｌ—Neｅｌsen)染色法与齐尔—加贝特(Ziehl-Gaｂbｅt)染色法。用石炭酸复红染色后,用盐酸乙醇分色,再用美蓝进行　HYＰERＬINK　”"　\t　"_blaｎk" 对比染色,即不再脱色而呈现石炭酸复红得红色。 抗酸染色得原理　HＹPEＲLINK "”　 分枝杆菌得细胞壁内含有大量得脂质,包围在肽聚糖得外面,所以分枝杆菌一般不易着色,要经过加热与延长染色时间来促使其着色。但分枝杆菌中得分枝菌酸与染料结合后,就很难被酸性脱色剂脱色,故名抗酸染色。 齐-尼氏抗酸染色法就是在加热条件下使分枝菌酸与石炭酸复红牢固结合成复合物,用盐酸酒精处理也不脱色、当再加碱性美兰复染后,分枝杆菌仍然为红色,而其她细菌及背景中得物质为蓝色。 抗酸染色一般步骤 HYＰEＲLINK ＂" １)初染 HYPＥＲＬＩNK ”” 　 　 　 　　　 　　　 　 　 　 　　 　　 　 　 　　 　 　 　 　　　　　 用玻片夹夹持涂片标本,滴加石炭酸复红2—3滴,在火焰高处徐徐加热,切勿沸腾,出现蒸汽即暂时离开,若染液蒸发减少,应再加染液,以免干涸,加热3－5分钟,待标本冷却后用水冲洗。 2)脱色 HYＰEＲLINK　＂" 3%盐酸酒精脱色３0秒~1分钟;用水冲洗。 ３)复染 ＨYPERLIＮK "" 用碱性美兰溶液复染1分钟,水洗,用吸水纸吸干后用油镜观察。 抗酸染色得染液配制 HYPEＲＬIＮK ”"　 1、石炭酸复红 碱性复红酒精饱与溶液　10mL 5%石炭酸　90ｍＬ 2、３％盐酸酒精 浓盐酸 3mL 95％酒精 97ｍL 3、吕氏美兰液 美兰酒精饱与液 30ｍL 氢氧化钾(1:10000) 100ｍL 细菌鞭毛染色得方法 目前,细菌鞭毛染色方法根据染色剂得不同,可分为碱性复红法、副品红法、结晶紫法、维多利亚蓝B法、镀银染色法与荧光蛋白染色法６类,前5类方法得媒染剂成分中均含有单宁酸,染色原理通常就是采用不稳定得胶体溶液做媒染剂,并使其沉淀于鞭毛上而使“鞭毛肿胀(taｒanｄ feather)",鞭毛直径加粗,进一步染色后即可在油镜下观察、?1.碱性复红法与副品红法1926年由Gｒaｙ首创,其媒染液成分包括２０％丹宁酸水溶液2.０ml,硫酸钾铝饱与水溶液5ml,饱与氯化汞水溶液２mｌ,３％碱性复红乙醇(9５%)溶液0、4ml,临用前混合,且需过滤后方可使用。染片时,媒染剂染色约６miｎ,具体时间尚需在试验中摸索确定,染色液就是抗酸染色Ｚiｅｈl—Neelsｅn石碳酸复红染液,染片时需要1小片吸水纸盖在涂片上,染色3mｉｎ。由于该方法媒染剂混合物不稳定、操作复杂、经验性强。Ｌeｉｆｓoｎ于１930年建立了副品红法,并于19３8年与１９５1年两次对该方法进行了改良,称为Lｅifｓｏｎ方法。染色试剂由3种溶液组成:A为1。5%NaCl水溶液,B为3％单宁酸水溶液,Ｃ为乙酸副品红0。9g,碱性副品红0、3ｇ溶解于1０0ｍl95%乙醇溶液中。使用时把等体积A与Ｂ混合,然后再加２体积C与之相混。该试剂冷藏可保存1~2个月。? 2。结晶紫法,又称Ｒyｕ法１937年由Ryu建立,1９8２年由Kodakａ等进行了改良、媒染剂:5%石碳酸1０ml,2g单宁酸与10 ml饱与硫酸钾铝、染色剂:饱与结晶紫乙醇溶液,即1２g结晶紫溶于100mｌ无水乙醇中。使用时把1０份媒染剂与１份染色剂混合,染色5min、1989年,Ｈeｉmbrooｋ等使用改良得Rｙu染色试剂,采用湿片技术进行鞭毛染色,虽然可以观察到细菌鞭毛,但效果不好、Ryu染色方法优点就是试剂比较稳定,目前Ｄｉfco公司已经研制出该方法得商品试剂盒,但染色效果亦不甚理想.?3. 维多利亚蓝Ｂ法1９９0年由Inｏue等报道日本制药株式会社SｈionｏgｉSeｉｙaku研制出一种细菌鞭毛染色商品试剂盒、其试剂组成包括维多利亚蓝B、苯酚、单宁酸与硫酸钾铝,染色约需7min。该试剂保存期约为６个月,关于其染色效果虽然有过一篇文献评述,但却没有采用评分法进行评价,很难判断其染色效果。?4.镀银染色法19５８年Rhodes根据Ｆｏntanａ得螺旋体改良镀银染色法,建立了一种细菌鞭毛镀银染色法、试剂分为媒染剂与银染剂、媒染液:10％单宁酸10ｍl加5 mｌ饱与硫酸钾铝水溶液,再加１ ｍｌ苯胺饱与水溶液形成沉淀,通过摇动又能重新溶解,加入5%ＦeＣｌ3水溶液１ml形成黑色溶液,稳定1０ min