omega真菌rna提取试剂盒r6840说明书(中文翻译版).docxVIP

实验概要 Omega 真菌RNA提取试剂盒中文说明书 （E.Z.N.A. Fungal RNA Kit） 。 实验前准备 高速离心机、无核酸酶的微量离心管（ DEPC灭菌EP管）、B -巯基乙醇、无水乙醇、液氮（冷冻 /破碎样 品）、灭菌的研钵、65 C预热的DEPC水（每个样品100卩1）。 实验前要用DEPC浸泡过夜并高压灭菌的东西有：蓝枪头、黄枪头、白枪头、 5ml枪头及各枪头盒，小瓶 （用来装乙醇等），EP管、玻棒、纱布（用来过滤菌丝）。研钵用锡纸包裹 180 C烘箱6h。 取适量RB裂解液，按1ml裂解液加入20ul 2-疏基乙醇。该混合液可于室温放置一周。 用DEPC水配置一小瓶 70%乙醇。 按下表用无水乙醇稀释 RNA Wash Buffer II ，并于室温保存。 R6840-00: 加入8ml无水乙醇 R6840-01: 加入48ml无水乙醇 R6840-02: 每瓶加入48ml无水乙醇 实验步骤 称取50-100mg 经液氮研磨成粉末状的真菌样品至 1.5ml离心管，立即加入500ul RB/2-Me, 剧烈 涡旋。 转移液体至匀浆柱（试剂盒中提供的绿色柱子）中。大于 13,000 xg离心5min。 转移收集管中的上清（注意不要吸到沉淀）至新离心管，加入0. 5倍体积无水乙醇或，涡旋混匀 15秒。 这一步如果发现有沉淀用注射器吹打或上下震荡 10-15次。（一般可转移450ul的上清液，可加入225ul 无水乙醇）。这一步如果发现有沉淀用注射器吹打或上下震荡 10-15次。 把RNA柱套在新收集管，转移所有的混合液（即使有沉淀）至 RNA柱子。室温10,000 Xg离心30 秒，弃去滤液。如果岀现堵柱现象，提高离心速度至 14, 000xg 。 （可选）膜上DNase消化： 1） 加入300ul RNA Wash Buffer I 至柱子中，按上柱条件离心，弃滤液； 2） 配制 DNase 消化液（Digestion Buffer , 73.5ul ; RNase-Free DNase I , 1.5ul），混匀。 3） 将上述消化液转移至柱子膜的正中央，不要将消化液转移至柱子内壁。 4） 室温静置15分钟。 加入500ul RNA Wash Buffer I 至柱子中，按以上条件离心，弃去滤液和收集管。 把柱子套在新2ml收集管（试剂盒提供），加入 700ul RNA Wash Buffer II （经过无水乙醇稀释的） 至柱子，按以上条件离心弃去滤液。 把柱子套回收集管，加入500ul RNA Wash Buffer II 至柱子重复第6步，按以上条件离心弃去滤液。 全速离心空柱1min以上甩干柱子基质。 注意：不要忽略此步 一一这对从柱子上除去乙醇至关重要。 RNA的洗脱。 把柱子装在干净的 1.5ml离心管上（自备），加入 50-100ul DEPC Water （试剂盒提 供）直接到柱子基质上室温静置 2min。10,000xg 离心1min洗脱出RNA。如果期望的RNA量较大（＞ 50卩g ）可以进行第二次洗脱。 称取50-100mgS液瓠硏彦的自怎粉未 ZBA500ul Buffer RB/2?Me?海锲裂解 离心去除不溶解质(14. OOOxg, 5min) 匀桨拄过滤逬 步去除杂灰(14.000xg.2min) ZD入0?5笆体枳无水乙醇?混匀 上拄吸附RNAdO. OOOxg. Imin) 可选:朕上75ul DNase消化15min@RT I 除蛋白质：400ul RNA Wash Buffer I洗涤; 脱盐：两次500ul RNA Wash Buffer 11 洗脱：30?100ul DEPC Water