FAK在白血病中的应用.docx

FAK  在白血病中的应用 １单个核细胞（ＭＮＣ）的分离 在无菌条件下采集骨髓液２ｍＬ，ＥＤＴＡ抗凝，用Ｆｉｃｏｉｉ淋巴细胞分离液（相对密 度１．０７７）分离ＭＮＣ，用１ ×ＰＢＳ洗涤２～３次。－８０℃冻存备用或直接提取Ｒ ＮＡ。 ２总ＲＮＡ的提取 用原平皓（天津）生物技术有限公司提供的ＲＮＡｐｕｒｅ超纯总ＲＮＡ离心柱式试剂盒提 取ＲＮＡ。经紫外线分光光度计测定ＲＮＡ纯度（Ａ２６０／Ａ２８０＞１．６），同时实 行ＲＮＡ定量测定。在１５ｇ／Ｌ琼脂糖凝胶上电泳可见３条清晰亮带，说明所提取ＲＮＡ 完整。 ３ｃＤＮＡ合成 应用Ｍ－ＭＶＬ逆转录试剂盒（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ公司）合成ｃＤＮＡ。逆转录反应体系 ２０ｍＬ，包括总ＲＮＡ１ μｇ，０．５ｇ／Ｌ的ＯＬｉｇｏ（ｄＴ）ｐｒｉｍｅｒ１ μＬ， 使用ＤＥＰＣ水补充至１２ μＬ。快速瞬时离心，置６５℃孵育５ｍｉｎ，立即置于冰上； 然后依次加入５５ ×缓冲液４ μＬ，ＲＮａｓｅ抑制剂１ μＬ，１０ｍｍｏＬ／ＬｄＮＴＰＭ ｉｘ２ μＬ，混匀，４２℃２ｍｉｎ；再加入逆转录酶（Ｍ－ＭＬＶ）１ μＬ，４２℃反应３ ０ｍｉｎ，７０℃下放置１０ｍｉｎ，冰上５ｍｉｎ。 ４ＰＣＲ反应 ＰＣＲ反应体系包括逆转录产物４ μＬ，２０ μｍｏｌ／Ｌ的ＦＡＫ正、反义链引物各１ μＬ， ２×ＰＣＲＭｉｘ１０ μＬ（其中包括１０ｍｍｏｌ／Ｌ的ｄＮＴＰｓ、１０ ×缓冲液、Ｔａ ｑＤＮＡ聚合酶），其余以ＤＥＰＣ水补足至２０ μＬ。所用引物根据ＧｅｎＢａｎｋ提供 的ＦＡＫｍＲＮＡ序列，由上海生工公司设计合成。 ＦＡＫ正义链为５ ′－ＴＡＴＴＧＧＡＣＣＴＧＣＧＡＧＧＧＡＴ－ＴＧＧ－３ ′，反义链为 ５′－ＧＡＧＧＣＧＧＴＴＴＣＴＴＴＧＧＴ－ＧＧＡＧＣ－３ ′，目的基因长度为２５５ｂｐ。 β－ａｃｔｉｎ正义链为５ ′－ＡＡＡＣＡＣＣＣＣＡＧＣＣＡＴＧＴＡＣＧＴ－３ ′反义链为 ５′－ＧＴＧＧＴＧＧＴＧＡＡＧＣＴＧＴＡＧＣ－３ ′，目的基因长度为２２８ｂｐ。内参照 与目的基因分别扩增，ＰＣＲ条件：９４℃预变性２ｍｉｎ；９４℃变性３０ｓ，６０℃退 火３０ｓ，７２℃延伸３０ｓ，４０个循环；７２℃再延伸５ｍｉｎ。 ５ＰＣＲ产物分析 取ＰＣＲ产物１０ μＬ与ＬｏａｄｉｎｇＢｕｆｆｅｒ２ μＬ混合，在１５ｇ／Ｌ琼脂糖凝胶 中电泳，８０Ｖ恒压电泳２５ｍｉｎ，ＥＢ染色。阳性结果可见２２８、２５５ｂｐ处各有 一条亮带，分别为 β－ａｃｔｉｎ和ＦＡＫ。紫外线透射仪观察并照相，照片经Ｍｅｔａ－ ｍｏｒｐｈＩｍａｇｉｎｇＳｉｇｈｔ软件实行分析并读取吸光度值，取ＦＡＫ与 β－ａｃ ｔｉｎ曲线下面积的比值作为ＦＡＫｍＲＮＡ的相对含量。 染色体的制备及Ｒ显带和核型分析 １染色体的制备将白血病病人骨髓细胞按（１～２） ×１０９／Ｌ的密度接种于ＲＰＭＩ１ ６４０培养基中，培养２４ｈ，加入０．０５ｍｇ／Ｌ秋水酰胺，３７℃孵育１ｈ。１０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，弃上清液，加入预温至３７℃的０．０７５ｍｏｌ／ＬＫＣｌ溶液８ｍＬ，３７℃孵育３０ｍｉｎ实行低渗。加入１ｍＬ固定液（甲酸∶乙醇＝３∶１）轻轻混匀实行预固定，离心后再实行３次固定，将最后一次固定的标本以１０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，弃上清液，加入适量固定液配成细胞悬液，备用。 ２染色体Ｒ显带采用气干法制片，将制备好的片子晾干，放入Ｒ显带液中，８７．５℃水浴７０～８０ｍｉｎ。取出片子水洗，晾干，再加Ｇｉｅｍｓａ液染色１５ｍｉｎ，水洗，干后镜检。 ３染色体核型分析每例病人分析１０～２０个分裂中期细胞，观察有无染色体异常。 统计学处理 应用ＳＰＳＳ１１．０软件实行统计学处理，两组率比较用 χ２检验和精确概率检验；计量数据以ｘ珚 ±ｓ表示，组间比较采用ｔ检验。 结果 １ＦＡＫｍＲＮＡ在ＡＬ病人骨髓ＭＮＣ中的表达 ＡＬ病人ＦＡＫｍＲＮＡ阳性表达率为６６．０％，与正常对照组（２０．０％）比较差异 有显著意义（ χ２＝５．４９，Ｐ＜０．０５）。其中ＡＬＬ和ＡＮＬＬ病人阳性表达率分别 为７１．４％和６３．９％，二者差异无显著意义（Ｐ＞０．０５），但两者均高于正常对 照组（Ｐ＝０．０４； χ２＝４．４４，Ｐ＜０．０５）。ＡＬＬ和ＡＮＬＬ病人ＦＡＫｍＲ ＮＡ的表达水平分别为０．７５ ±０．１２和０．６５ ±０．１７，二者差异无显著性（Ｐ＞ ０．０５），但与正常对照组（０．３１ ±０．１５）比较，差异有显著意义（ｔ＝７．９８、５．６０，Ｐ＜０．０５）。部分病人电泳结果见图１。 ２ＦＡＫｍＲＮＡ在不同时期ＡＬ病人的表达 初诊组和复发组ＡＬ病人白血病细胞ＦＡＫｍＲＮＡ的阳性表达率分别为８０．０％、８ ５．７％，两组比较差异无显著性（Ｐ＞０．０５），但均高于正常对照组（ χ２＝９．３８， Ｐ＜０．０５；Ｐ＝０．０２）。初诊组和复发组Ａ