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第四章 聚合酶链式反应;;4.1 PCR技术简史;4.1 PCR技术简史;;72℃;PCR仪;;4.2 PCR反应原理;双链DNA在受热后，配对碱基的氢键断裂，DNA两条链分开成为单链。;TGCATGCAT;DNA聚合酶按碱基配对原则延伸DNA链。;理论上25-30次循环就可以合成225-230条DNA。;PCR反应曲线;4.3 PCR的过程;;第二步——第三步——第四步;;需要的模板量极低。;RT-PCR：;4.5 标准的PCR反应体系;自从H.A. Erilish分离出耐高温的Taq DNA聚合酶，代替大肠杆菌DNA聚合酶Klenow片断（37 oC )，PCR技术才进入实用阶段。;最适温度： 72-78 oC 延伸速度： 约1000nt/min酶分子 最长延伸长度：6.7kb;金属离子敏感（尤其是Mg2+ ）。 当dNTP（能结合Mg2+）的浓度为0.7-0.8mmol/L时，MgCl2的最佳浓度应是2.0mmol/L。;与待扩增的模板DNA区段的两3’端序列互补（ 5‘端相同）的短DNA。;即2.75?1011 bp的基因组中有一次完全与19个核苷酸的序列相同的机会（或机会是约2×10-11）。;③引物的碱基序列 ;尽可能提高G+C含量，以提高引物与模板的结合力;;⑤引物的Tm值;;设计多组引物，结合位点依次位于前一组引物之间。增加扩增产物的特异性。;dNTP呈颗粒状， 保存不当易变性失 dNTP溶液呈酸性，使用时应小量分装，-20℃冰冻保存，多次冻融会使dNTP降解 在PCR反应中，dNTP应为50～200umol/L，浓度过低会降低PCR产物的产量 dNTP可与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度下降，影响DNA聚合酶的活性;（4）模板DNA;Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响 在一般的 PCR反应中，dNTP浓度200umol/L时，Mg2+浓度为1.5～2.0 mmol/L为宜 Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增， 浓度过低会降低 Taq DNA聚合酶的活性，使反应产物减少;① 一定范围内提高退火温度； ② 缩短退火和延伸时间，可减少错误引发及 多余的DNA聚合酶参与酶促延伸的机会； ③ 降低引物和酶的浓度可以减少错误引发， 尤其是能减少引物二聚体的引发； ④ 改变Mg2+的浓度；;⑤ 引物设计的特异性； ⑥ 减少循环次数； ⑦ 热启动（Hot Start） ⑧ 采用二对引物即外引物和内引物进行扩增来 提高扩增的特异性。;典型的引物1５到30个核苷酸长 ； 选择GC含量为45％到55％碱基的分布是随机的； 避免引物间和引物内产生４碱基???上互补； 避免3‘末端的错误配对； 设计5‘端和中间区为G或C的引物； 避免引物对3‘末端存在互补序列； 避免3‘末端富含GC，设计引物时保证在最后5个核苷中含有3个A或T。 避免存在可能会产生内部二级结构的序列。;引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性 引物量：每条引物的浓度0.1 ~ 1umol或10 ~ 100 pmolRT-PCR 引物设计特别注意：跨越两个外显子 附加序列:目的序列上并不存在的附加序列，如限制位点和启动子序列，可以加入到引物5’端而不影响特异性。;引物5′端修饰技术 修 饰 法 用 途 附加核酸序列： 酶切位点 克隆（如定向克隆） 噬菌体启动子 合成RNA探针、测序 蛋白质结合序列 产物纯化、检测 核糖体结合序列 高效表达 其它 构建载体、重组子等 ; 4.8　聚合酶链式反应技术类型;选定一个温度范围，如50——35，每个温度2循环，然后在35度15循环。其原理是，随着退火温度的降低，特异性逐步降低，但特异性条带在温度较高时已经扩增出来，其浓度远远超过非特异性条带，随着退火温度的降低，特异性条带优先被扩增。这种方法的退火温度范围较大，在不知道最佳退火温度时比较适合。;竞争引物PCR ： 有一个碱基变化的两种引物在较宽松的复性条件下竞争DNA模板，其中只有完全互补的引物才能大量配对。该法可用于测定某一DNA片段上是否带有某一已知碱基置换。;不对称PCR ;锚定PCR： 锚定PCR是在未知DNA cDNA片段的一个末端人工接上一个已知序列片段,利用一个基因特异引物与这个人工序列区引物（锚定引物）进行扩增，所以它是一种半特异性扩增。 ;反向PCR： ;;; 兼并引物是指代表编码单个氨基酸所有不同碱基可能性的不同序列的混合物。兼并度越低，产物特