细胞培养技术入门【爆款】.ppt

37℃培养箱（或5%CO2培养箱）中培养 24小时后换液 去处对细胞生长有毒物质，如DMSO、细胞组织残渣、细胞代谢产物 贴壁细胞 悬浮细胞 直接去掉上清液 离心去掉上清液，必要时做细胞饲养层以净化细胞 传代 细胞生长80％以上覆盖培养瓶底，根据细胞生长周期不同而异， 2－3天或1周左右一代 贴壁细胞 悬浮细胞. 消化法，用胰酶－EDTANa2消化， 直接吹打或离心法、自然沉淀法， 时间根据细胞而定 吸一半液到另一瓶? 冻存 .精品课件. * 冻存程序 ★ 细胞冻存管写好标签：细胞名称，时间及保存人。 ★ 取对数生长期的细胞（2～5 ×1O5cells／ml），收集细胞前24h换液； ★ 吸出培养液，用PBS洗细胞一次，除去，加入消化液胰蛋白酶－EDTANa2（消化时间根据细胞而定），去掉消化液，加入培养液充分混匀，1000rp离心1min ,去掉上清液； ★ 重悬浮于冻存液中，大约1～5 ×106cells／ml； ★ 每个冻存管中加入lml细胞悬浮液，拧紧盖子。 ★ 冷冻细胞应缓慢降温，可用装有异丙醇的冷冻盒30min ～1h后,再放入-200C冰箱中2h左右，然后转至-800C冰箱，可保存数月，如需长期保存，应在-800C冰箱中放3h ～8h后转至液氮中。 .精品课件. * 细胞计数 一、原理 ? ????? 细胞计数结果以细胞数/毫升表示。在细胞群体中总有一些因各种原因而死亡的细胞，总细胞中活细胞所占的百分比叫做细胞活力，由组织中分离细胞一般也要检查活力，以了解分离的过程对细胞是否有损伤作用。复苏后的细胞也要检查活力，了解冻存和复苏的效果。?  .精品课件. *  用台盼（酚）兰染细胞，死细胞着色，活细胞不着色，从而可以区分死细胞与活细胞。利用细胞内某些酶与特定的试剂发生显色反应，也可测定细胞相对数和相对活力。 .精品课件. * 二、仪器、用品与试剂1、仪器与用品：普通显微镜、血球计数板、EP管、毛细吸管等。?2、试剂： SP20细胞、 0.4％台盼（酚）兰其配方是：台盼（酚）兰 0.4g加双蒸水100ml等。 3、材料：细胞悬液 .精品课件. * 细胞悬液的制备： 用毛吸管吸5滴细胞悬液到EP管中，加入1滴0.4％台盼蓝染液或苯胺黑，混匀，静置2～3min,活细胞不会被染色，而死细胞着蓝色，这样加入染液后就可以在显微镜下区别活细胞和死细胞。  .精品课件. * 三、操作步骤 ? 1、将血球计数板及盖片用软纱布擦试干净，并将盖片盖在计数板上。 2、将细胞悬液吸出少许，滴加在盖片边缘，使悬液充满盖片和计数板之间。 3、静置3分钟。 .精品课件. * 4、镜下观察，计算计数板四个大格细胞总数，压线细胞只计左侧和上方的。然后按下式计算： （细胞悬液的细胞数）/ml＝ （ 四个大格子细胞数/4)×稀释倍数×104 /ml .精品课件. * 四、细胞计数要点： 1.要求悬液中细胞数目不低于104个/ml，如果细胞数目很少要进行离心再悬浮于少量培养液中； 2.要求细胞悬液中的细胞分散良好，否则影响计数准确性。 3.取样计数前，应充分混匀细胞悬液，尤其时多次取样计数时更意每次取样都要混匀，以求计数准确； .精品课件. * 4.操作时，注意盖片下不能有气泡，也不能让 悬液流入旁边槽中，否则要重新计数。 5.数细胞的原则是只数完整的细胞，若细胞聚 集成团时只按照一个细胞计算。如果细胞压在格 线上时，则只计上线，不计下线，只计左线，不 计右线。 .精品课件. * .精品课件. * 体外细胞的复苏与培养 概述 复苏细胞与冻存的要求相反，应采用快速融化的手段。这样可以保证细胞外结晶在很短的时间内即融化。避免由于缓慢融化使水分渗入细胞内形成胞内再结晶对细胞造成损害。 .精品课件. * 用品和试剂 培养液、吸管、离心管、培养瓶、CHO/Hela细胞等。 操作步骤（图） .精品课件. * 注 意 ★ 存取冻