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PAGE PAGE 7 人肝癌细胞凋亡影响半胱氨酸蛋白酶论文 【摘要】研究日本新近研制的第三代3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A（3-hydroxy-3-methyl-glutaryl-CoA，HMG-CoA）还原酶抑制剂匹伐他汀（pitavastatin，NK-104）对人肝癌细胞凋亡及半胱氨酸蛋白酶3（caspase-3）活性的影响。方法:采用细胞培养技术，以肝癌细胞系HepG2为靶细胞，以不同浓度的药物处理细胞48h后，利用WST-8法测定NK-104对细胞增殖的影响;利用荧光染料Hoechst33258染色，荧光显微镜观察细胞核碎片;以流式细胞仪分析细胞周期的变化;采用半胱氨酸蛋白酶3比色法检测caspase-3活性。结果:NK-104（10μmol/L）对HepG2细胞有明显抑制作用，可诱导HepG2细胞凋亡，并能增强caspase-3基因的活性。结论:NK-104能够诱导HepG2细胞凋亡，其机制与caspase-3依赖性凋亡调节信号通路有关。 【关键词】肝癌 3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A（3-hydroxy-3-methyl-glutaryl-CoA，HMG-CoA）还原酶抑制剂，统称为抑制素，是重要的脂类合成抑制剂，主要在人体肝脏中代谢，临床上广泛应用于治疗高脂血症［1］。最近研究发现，HMG-CoA还原酶抑制剂具有生物学多效性，与降血脂无关。有报道其在体外具有抗癌作用［2］、体内与5氟尿嘧啶（fluorouracil，5-Fu）共同作用能够延长晚期肝癌患者的生存期［3］。匹伐他汀（pitavastatin，NK-104）是日本新近研制的第三代高效HMG-CoA还原酶抑制剂［4］。在血管内皮细胞系NK-104通过磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B（phosphoinositide3-kinase/proteinkinaseB，PI3K-Akt）基因激活途径对内皮细胞的保护作用已有报道［5］，但其在肝癌细胞系的抗癌作用尚未见报道。本文在肝癌细胞系HepG2通过2-（2-甲氧基-4-硝基苯）-3-（4-硝基苯）-5-（2，4-二硫代苯）-2H-四氮唑单钠盐｛［2-（2-methoxy-4-nitrophe-nyl）-3-（4-nitrophenyl）-5-（2，4-disulfophenyl）-2H-tetrazolium，monosodiumsalt］，WST-8｝、荧光染料Hoechst33258染色、流式细胞仪和半胱氨酸蛋白酶3比色法等检测方法，研究NK-104对人肝癌细胞凋亡及半胱氨酸蛋白酶3（caspase-3）活性的影响，为NK-104在抗肿瘤中的作用机制提供实验依据。 1材料和方法 1.1主要材料与仪器NK-104，日本兴和有限公司（日本名古屋）和日产化学工业公司（日本东京）产品;荧光染料Hoechst33258、甲羟戊酸（mevalonicacid，MEV）和碘化丙啶（propidiumiodide，PI）染色液（PI100g/L，1%Triton100，9g/LNaCl），Sigma公司产品。流式细胞仪，2000FCA，美国BD公司产品。 1.2实验方法 1.2.1细胞培养人肝癌细胞株HepG2（美国ATCC公司产品）在含10%胎牛血清的DMEM培养基、5%CO2、37℃条件下培养。实验中，细胞种植于适当培养皿中，90%的细胞融合时，用磷酸盐缓冲液洗净后，加入适量含有NK-104和MEV（1mmol/L）等药物的培养液，37℃培养箱中培养。 1.2.2WST-8方法利用WST-8试剂盒对细胞增殖进行测定。HepG2细胞（1×104个细胞/孔）接种于含100μl培养液的96孔培养板中，NK-104（0.1～100μmol/L）治疗48h后，分别加入WST-8试剂10μl（日本同仁化学研究所）培养2h后，选择450nm波长，测定各孔的吸光度OD值。 1.2.3Hoechst33258染色细胞经药物刺激48h后，甲醇-冰乙酸（3∶1）细胞固定液4℃固定5min，磷酸盐缓冲液稍洗后，点加Hoechst33258染色液，10min。用滤纸沾去多余液体，封片剂封片后荧光显微镜观察细胞核碎片。 1.2.4流式细胞仪检测凋亡峰在室温下将刺激48h后的细胞用冷磷酸盐缓冲液洗涤2次，并在适当的染色缓冲液中吸取100μl的细胞（1×105）至试管中。加入200μlRNaseA，37℃水浴30min，再加800μlPI染色液混匀，4℃避光30min后，立即上机分析。 1.2.5半胱氨酸蛋白酶3比色法经药物治疗48h后收集细胞，采用半胱氨酸蛋白酶3比色法试剂盒按照厂家说明进行测定（Medical&BiologicalLaboratoriesC