2021手工碱裂解法抽提质粒试剂溶液I.pptVIP

质粒 (plasmid) 特点 能在宿主细胞内独立自主复制；带有某 些遗传信息 , 会赋予宿主细胞一些遗传性状。 载体的选择标准 ? 能自主复制； ? 有克隆位点（外源 DNA 插入点），常具有 多个单一酶切位点，称为 多克隆位点 ； ? 具有两个以上的 遗传标记 ，便于重组体的筛 选和鉴定； ? 分子量小，以容纳较大的外源 DNA 。 质粒的复制型 质粒在细胞内的复制一般有两种类型 : – 严谨型 (Stringent control) ：只在细胞 周期的一定阶段进行复制，当细胞染 色体复制一次时，质粒也复制一次， 每个细胞内只有 1 ～ 2 个质粒 – 松弛型 (Relaxed control) ：质粒在整 个细胞周期中随时可以复制，当染色 体复制停止后，质粒仍然能继续复制， 每个细胞中含有 10-200 个拷贝。 实验目的 ? 掌握碱裂解法抽提质粒的 原理 、 步骤 及 各 主要试剂的作用 。 质粒提取的主要步骤： ? 细菌的培养 ? 细菌的收集和裂解 ? 质粒 DNA 的分离和纯化 提纯的思路 ? ? 质粒的特性：共价、闭合、环状的小分子量 DNA 要去除的物质： 蛋白 基因组 DNA RNA 碱裂解法抽提质粒 1. 手工碱裂解法抽提质粒 2. 质粒提取试剂盒 ( 离心柱型 ) 实验原理 ? 碱法提取主要是利用共价闭合环状质粒与线性染色质在 拓扑学上的差异 来分离它们。 ? 在 碱性 pH ，染色体 DNA 的氢键断裂，双螺旋结构解开； 质粒 DNA 的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状 的两条链不会完全分离。 ? 当 用 pH4.8 的 KAc 或 NaAc 高盐缓冲液调节其 pH 值到中性 时， 质粒 DNA 分子 能够迅速准确地复性，呈溶解状态， 离心时留在 上清 中；而线状染色体 DNA 则不能复性，形 成缠绕的网状物，通过离心，染色体 DNA 与不稳定的大 分子 RNA 、蛋白质 -SDS 复合物一起沉淀下来而被除去。 ? 再用 酚氯仿抽提 进一步纯化质粒 DNA ，用 无水乙醇 沉淀 质粒 DNA 。 手工碱裂解法抽提质粒 试剂： ? 溶液 I ： 50mM 葡萄糖， 25mMTris· HCl （ pH8.0 ）， 10mM EDTA 作用： 分散细胞，鳌合金属离子使金属酶失活 ? 溶液 II ： 0.2N NaOH ， 1%SDS （新鲜配制） 作用： 细胞壁肽聚糖碱性下水解，核酸和蛋白质 变性。 ? 溶液 III ： 5M KAC 作用：酸性条件下质粒 DNA 复性，变性蛋白－ ＋ SDS ＋线性 DNA 沉淀， K 可中和 DNA ☆原理示意图 ? 平衡酚：氯仿：异戊醇 （ 25 ： 24 ： 1 ） 作用：氯仿可使蛋白质变性并有助于液相与有机 相的分离。平衡酚 pH7.8 （酸性下 DNA 分配于有 机相，酚的密度大），可使 DNA 在上清中。异戊 醇有助于消除抽提过程中出现的泡沫。 ? 无水乙醇： 除去 DNA 水化层， 使 DNA 沉淀 ? TE 缓冲液： 溶解 DNA ? 碱裂解法流程图 对数期菌体 上清液（含 DNA) TE 溶解 DNA 溶液 I 充分重悬 酚抽提 ( 去蛋白） 质粒 DNA 溶液 溶液 II 裂解 乙醇沉淀 DNA 溶液 III 中和 洗涤沉淀 [ 质粒提取试剂盒组成 ] 平衡液 BL STE 缓冲液（ 溶液 P1 ） Lysis Buffer （ 溶液 P2 ） 3M NaAc ， pH 4.8 （ 溶液 P3 ） 去蛋白液 PD 漂洗液 PW 洗脱缓冲液 EB 离心吸附柱 废液收集管 RNaseA （ 10mg/ml ） [ 实验准备 ] 1. 使用本试剂盒之前，先在溶液 P1 中加入 RNaseA 。溶液 P1 使用完毕后，请立即至于 4 ℃保存。 2. 漂洗液 PW 在第一次使用前需加入无水乙醇， 15ml 的漂 洗液中需加入 60ml 的无水乙醇，混匀后方可使用。 3. 使用前先检查平衡液 BL 、溶液 P2 和 P3 是否出现浑浊， 如有浑浊现象，可在 37 ℃水浴中加热几分钟，即可恢复 澄清。 实验仪器与材料 （一）仪器：超净工作台， 恒温摇床，台式离心机， 高压灭菌锅 （二）材料： 1.5ml 离心管， 加样枪，含有质粒 pQE30 的大肠杆菌