详细版流式细胞仪(2014年).ppt

.精品课件. * III 流式细胞仪的性能指标 荧光分辨率：表示仪器测量所能达到的最大精度，通常用变异系数表示。目前，仪器的荧光分辨率都在2%以下。 荧光灵敏度：表示仪器所能检测到的最少荧光量，通常用能检测到的最少的异硫氰酸荧光素（FITC）分子来表示。一般仪器的荧光灵敏度为3000个FITC分子。 前向角散射光灵敏度：以前向角散射光能检测到的最小颗粒直径表示。一般仪器可检测到的最小颗粒直径在0.3um左右。 .精品课件. * I I 流式细胞仪的基本结构（２） FACS Calibur 流式细胞仪的样品流动 .精品课件. * I I 流式细胞仪的基本结构（３） 信号接收系统 流式细胞仪主要接收细胞的散射光信号和荧光信号，并将其转换为与散射光和荧光强度成正比的电压脉冲。 .精品课件. * I I 流式细胞仪的基本结构（３） 细胞通过测量区时信号的产生 .精品课件. * I I 流式细胞仪的基本结构（３） 细胞通过测量区时信号的产生：电压脉冲的形成 .精品课件. * I I 流式细胞仪的基本结构（３） 散射光信号 细胞在通过激光测量区时，在空间360°立体角的所用方向散射光线，散射光信号与细胞大小、形状、质膜及细胞内部的折射率有关。在流式细胞仪中，通常在前向角和侧向角接收和检测细胞散射光，前者的检测器多用 硅光电二极管，后者的检测器多用光电倍增管。 .精品课件. * I I 流式细胞仪的基本结构（３） 散射光信号 ① 前向角散射光（forward scatter，FSC）：亦称小角散射或0°散射。激光在此方向上有较强的衍射光，当用遮光板除去本底光的影响时，该方向上的散射光强度是d/λ的函数，λ表示激光波长，d表示细胞大小。FSC参数反映细胞的大小和尺寸。 ② 侧向角散射光（side scatter，SSC）：亦称大角散射或90°散射。激光在此方向上衍射光明显减弱，而以反射光、散射光成分为主。SSC参数反映细胞内颗粒物质的大小和多少，可获取有关细胞内部的精细结构和颗粒性质的有关信息。 .精品课件. * I I 流式细胞仪的基本结构（３） 散射光信号 .精品课件. * I I 流式细胞仪的基本结构（３） 荧光信号（fluorescence，FL） 被荧光染料染色的细胞在通过测量区时，细胞中的特异荧光染料受激发而产生荧光信号，其强度表示待检测物质的多少。荧光信号检测系统由滤片和检测器组成，与入射激光成90°放置。滤片用以滤除非荧光信号；荧光检测器多用光电倍增管。荧光波长与激发光波长不同且强度转弱，须使用一系列灵敏的光学元件才能分离出不同的荧光信号。 .精品课件. * I I 流式细胞仪的基本结构（３） 荧光信号：细胞中荧光素含量与信号的关系 .精品课件. * I I 流式细胞仪的基本结构（３） 荧光信号：细胞中荧光素分布与信号的关系 .精品课件. * I I 流式细胞仪的基本结构（４） 信号处理系统 检测器以每秒1000~2000个细胞的速度探测细胞的散射光和荧光信息，经过A/D转换器变成二进制信号，储存于计算机中，每个细胞的光散射及荧光测量数据一般以列表或矩阵方式储存。计算机通过综合、处理、分析这些信息，可直接计算出所需结果。 .精品课件. * I I 流式细胞仪的基本结构（４） 电压脉冲定量分析与数字转换（1） .精品课件. * I I 流式细胞仪的基本结构（４） 电压脉冲定量分析与数字转换（2）：脉冲高度 .精品课件. * I I 流式细胞仪的基本结构（４） 细胞信号的显示 ① 一维直方图（histogram） 单参数直方图表示一个参数与细胞数量间的关系。在图中，横坐标（X轴）表示荧光或散射光强度的相对值，其单位用在流式细胞仪中用“道（channel）”表示，道数与荧光强度之间是线性或对数关系，依仪器分析时放大器的性质而定。纵坐标（Y轴）通常代表细胞出现的频率或相对细胞数量，绝对细胞数较少使用。在直方图中，每个峰表示在某些方面性质相同的一群细胞，若用“标尺”把各峰分开成区间，即可统计分析出各个区间内细胞所占百分比、及光散射或荧光强度的峰值、平均值、标准差、变异系数等。 .精品课件. * I I 流式细胞仪的基本结构（４） 直方图 7 6 5 4 3 2 1 0 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 6 7 7 6 5 4 3 2 1 0 4 5 3 0 2 4 1 0 X Y .精品课件. * I I 流式细胞仪的基本结构（４） 直方图 .精品课件. * I I 流式细胞仪的基本结构（４）