试验五线粒体的分离与观察.ppt

实验五 线粒体的分离与观察 一、实验目的 1. 对分离得到的线粒体进行活性鉴定。 2. 掌握用差速离心技术分离制备线粒 体的方法。 二、实验原理 ? 细胞器是细胞中维持细胞复杂生命活动的功能 性器官，为了研究各种细胞器的功能，首先就 要将这些细胞器从细胞中分离出来。利用各种 物理方法（研磨、超声波振荡、低渗等将组织 制成匀浆，细胞中的个中亚组分即从细胞中释 放出来。 ? 细胞内不同结构的细胞器大小密度存在差异， 因此不同细胞器在介质中的沉降系数各不相同 。根据这一原理，常用不同转速的离心法来分 离不同的细胞器。分级分离的方法有差速离心 ? 分离细胞器最常用的方法是将组织制成匀 浆，在均匀的悬浮介质中用差速离心法进 行分离，其过程包括组织 细胞匀浆 、 分级 分离 和 分析 三步，这种方法已成为研究亚 细胞成分的化学组成、理化特性及其功能 的主要手段。 (1) 匀浆 (Homogenization) 低温条件下， 将组织放在匀浆器中，加入等渗匀浆介质 ( 即 0.25mol ／ L 蔗糖 ) 进行破碎细胞使之成 为各种细胞器及其包含物的匀浆。 (2) 分级分离 (Fractionation) 由低速到高速离 心逐渐沉降。先用低速使较大的颗粒沉淀， 再用较高的转速，将浮在上清液中的颗粒沉 淀下来，从而使各种细胞结构，如细胞核、 线粒体等得以分离。由于样品中各种大小和 密度不同的颗粒在离心开始时均匀分布在整 个离心管中，所以每级离心得到的第一次沉 淀必然不是纯的最重的颗粒，须经反复悬浮 和离心加以纯化 . (3) 分析 分级分离得到的组分，可用细胞化 学和生化方法进行形态和功能鉴定。 中性红 - 詹纳斯绿染色 詹纳斯绿（ Janus green B ）是对线粒 体专一的活细胞染料，毒性很小，属于碱 性染料，解离后带正电，由电性吸引堆积 在线粒体膜上。由于线粒体内具有细胞色 素氧化酶系，能使詹纳斯绿保持在氧化状 态（淡蓝绿色），在胞质区詹纳斯绿则被 还原为无色。中性红的阳离子可与带有一 定负电荷的原生质及细胞核结合，而使原 生质与细胞核染色。 离心技术概述 ? 离心技术是根据颗粒在作匀速圆周运动时都会受 到一个向外的力这一原理而发展起来的一种分离 技术。 ? 离心力是颗粒在一定角度速度下作圆周运动受到 一个向外的力。与角速度和旋转半径有关。 ? 相对离心力又称相对离心加速度，是指离心力相 当于重力加速度的倍数，表示“数字× g ”。 离心力 g ＝ 1.11 × 10 -5 n 2 r r 为离心机中轴到离心管远端 的距离 n 为离心机每分钟的转速（ r/min ） 1000g=9.8 牛（ N ） 离心技术类型 ? 离心技术可用于细胞器的分离。 ? 离心技术一般包括：差速离心和密度梯度离心 （一）差速离心 （ differential centrifugation ） ? 在密度均一的介质中由低速到高速逐级离心，用于分离 不同大小的细胞和细胞器。 ? 差速离心法是指有低速到高速逐级沉淀分离，使 较大的颗粒先在较低速中沉淀，再用较高的转速 将原先悬浮于上清夜中的较小颗粒分离沉淀下来 ，从而使各种亚细胞组分得以分离。 ? 但由于样品中各种大小和密度不同的颗粒在离心 十是均匀分布于整个离心介质中的，故每级分离 得到的第一次沉淀必然不是纯的最重的颗粒，需 经反复悬浮和离心加以纯化。 （二）密度梯度离心 （ density gradient centrifugation ） A 等速度沉降， B 等密度沉降 ? 用一定的介质在离心管内形成一连续或不连续的密度 梯度，将细胞混悬液或匀浆置于介质的顶部，通过重 力或离心力场的作用使细胞分层、分离。 ? 密度梯度离心法是用密度具有梯度的介质来替换 离心管中的密度均一的介质，使介质分为不同的 层次，浓度的低的在上层，浓度高的在底层。将 细胞匀浆加在最上层，随后离心。这样，不同大 小、形态、密度的颗粒就会以不同的速度向下移 动，集中到不同的区域，可以分别收集。 ? 细胞器分离过程中的悬浮介质常使用水溶性的蔗 糖溶液，因为它比较接近细胞质的分散相，在一 定程度上，能保持细胞器的结构和功能，保持酶 的活性，避免细胞器的聚集。 沉淀 转速 x 时间 内 容 物 A 150g x 20min 完整细胞 B 1000g x 20min 细胞核，细胞碎片 C 3000g x 6min 叶绿体 D 10000g x20min 线粒体、溶酶体、微体 E 105000g x120min 微粒体 F 105000g x 20min 0.26% 脱氧胆酸纳 核糖体 三、实验材料、用品 1. 器材： 剪刀，漏斗，研钵，纱布，离心管，显微 镜，冷冻高速离心机等。 2. 材料： 玉米黄化苗 四、玉米线粒体及细胞核的分离