试验四考马斯亮蓝方法和bca法.ppt

实 验 四： 蛋白质的定量测定 考马斯亮蓝法（ Bradford ）和 BCA 法 实验目的及要求 ? 了解考马斯亮蓝法（ Bradford 法）和 BCA 法 的原理及干扰因素 ? 掌握标准曲线法测定蛋白质含量的方法 蛋白质检测及含量的测定 一、化学检测 1 、凯氏定氮法（ Kjeldahl) ： 0.2~1.0 mg/ml ( 平均含氮量 16%) 2 、双缩脲法（ Biuret ）： 1~10 mg/ml （肽键在碱性溶液中与铜离子络合呈紫红色） 3 、 Folin- 酚试剂法（ Lowry ）： 20-250 m g/ml （干扰因素多） 4 、考马斯亮蓝法（ Bradford ）： 10~100 m g/ml （受蛋白质内氨基酸组成影响较大） 5 、 BCA 法（ bicinchoninic acid 二喹林甲酸）： 5-200 m g/ml ； MicroBCA ： 0.5-20 m g/ml ； 二、光学检测 1 、荧光检测：邻苯二甲醛（ OPT ）法，强还原剂与氨基酸 / 肽反应产生强荧光性 化合物，激发波长为 340nm, 荧光波长为 455nm ，可用于氨基酸自动分析系统。 2 、紫外光检测： 10 m g/ml （芳香族氨基酸残基对 280nm 的紫外光有最大吸收） 三、电泳或免疫化学检测 ：如 PAGE 、 Western Blot 、 ELISA 等 考马斯亮蓝 G250 （ Coomassia Brilliant Blue G-250 ）能在酸性溶液中 与蛋白质的疏水区结合，最大光吸收 峰从 405nm 变为 595nm ，溶液的颜色 也从棕黑色变为蓝色，所显示蓝色至 少在 1 小时内是稳定的。在一定浓度 范围内，复合物的光密度与蛋白质含 量呈线性关系。 优点 ：灵敏度高， 0-100 m g/ml ； 测定快速、简便，颜色可以在 1 小时内保持稳 定 ; 干扰物质少。 缺点 ：由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此 Bradford 法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差；去污剂、甘油、乙酸和 0.1 M 的 NaOH 会 干扰此法的测定。 BCA 法 原理 BCA （ 2,2- 联喹啉 -4,4- 二甲酸二钠， Bicinchoninic acid ）能与含二价铜离子的硫酸铜组 成 BCA 工作试剂。在碱性条件下，二价铜离子可 以被蛋白质还原成一价铜离子，一价铜离子与 BCA 相互作用，两分子的 BCA 螯合一个铜离子， 形成紫色复合物。在 562nm 处显示强吸光性。在 一定浓度范围内，复合物的光密度与蛋白质含量 呈线性关系。 优点 ：准确灵敏 ,5-200 m g/ml; 测定快速简便；经济实用 ; 干扰物质少；检测不同 蛋白质分子的变异系数远小于 Bradford 法 缺点 ：与荧光蛋白质定量等方法相比，属于化学呈色法的 BCA 法检测灵敏度尚 不够。蔗糖、尿素、 NH4 + 和 EDTA 影响测定结果。 每种蛋白质测定法各有其优缺点 在选择方法时应考虑的因素 ①实验对测定所要求的灵敏度和精确度； ②蛋白质的性质； ③溶液中存在的干扰物质； ④测定所要花费的时间 实验内容 1 、制备蛋白样品； 2 、分别制作两种测定方法的标准曲线； 3 、分别用两种方法测定样品。 实验流程 1 制备总蛋白样品： 小白菜（梗 + 叶） 10 g ，碾成匀浆，加水 10 ml 后继 续碾 10 min ，倒入离心管中，另加 20 ml 水将剩余物洗入两 个 50 ml 离心管，称重平衡后 10000 r/min 离心 10 min 。小心 地将少量上清（约 15 ～ 20 ml ）倒入小烧杯，取烧杯中上 清 10 ml 定容到 100 ml ，待测。 用量筒量取剩余上清的体积，计算上清总体积。 管号 ml 样品 1 2 3 4 5 6 7 C 白菜抽提液 标准蛋白质 100 m g/ml 0 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8 1 X' X1 X2 X3 H 2 O 1 0.9 0.8 0.6 0.4 0.2 0