试验三蛋白质的盐析分离和凝胶层析.ppt

蛋白质的盐析分离和凝胶层析脱盐 ? 蛋白质的盐析分级分离 ? SephadexG-25 脱盐 ? 盐离子的跟踪检测 ? ＵＶ检测蛋白质 蛋白质提取、分离、纯化及鉴定技术 ? 材料：取材一定要新鲜，在低温下操作 ? 破细胞：匀浆器，研钵，超声波，反复冻融，化学方法，酶解等 ? 蛋白质提取：根据物质的性质，水、盐溶液、稀酸、稀碱、有机溶剂 ? 蛋白质分级分离：盐析分级分离、有机溶剂分级分离、等电点分离 ? 进一步纯化：透析、柱层析：分子筛、离子交换、亲和层析、 HPLC ? 鉴定 电泳：薄层电泳（纸， NC 膜）、凝胶电泳（ PAG ，琼脂，淀粉）； 结构分析； 活性分析；呈色反应 ? 含量测定： fonlin 酚法、考马斯亮蓝 G250 法等。 一些常用的蛋白质纯化中的仪器 机械细胞破碎仪 超声波细胞破碎仪 ? 色谱工作站 WINDOWS 98 作为 色谱分析的数据采集 和处理，后端采用数 据库工具 MS-SQL 在 网络上进行分析结果 的存档、检索及打印 等。 ? 高效液相色谱仪 蛋白质的盐析分离原理 用大量中性盐使蛋白质从溶液中析出的过程称为蛋白 质的 盐析作用 。蛋白质是 亲水胶体 ，在高浓度的中性盐影 响下脱去 水化层 ，同时，蛋白质分子所带的 电荷被中和 ， 结果蛋白质的 胶体稳定性 遭到破坏而沉淀析出。经透析或 用水稀释时又可溶解，故蛋白质的盐析作用是 可逆过程 。 分子量大的蛋白质（如球蛋白）比分子量小的（如白蛋白） 易于析出。改变盐浓度，使不同分子量的蛋白质分别析出。 凝胶层析原理 ? 凝胶层析又称排阻层析，凝胶过滤，渗透层析或分子筛层析等 。 ? 对于某种型号的凝胶，一些大分子不能进入凝胶颗粒内部而完全 被排阻在外，只能沿着颗粒间的缝隙流出柱外（所用洗脱液的体 积为外水体积）；而一些小分子不被排阻，可自由扩散，渗透进 入凝胶内部的筛孔，尔后又被流出的洗脱液带走（所用洗脱液的 体积为内水体积）。分子越小，进入凝胶内部越深，所走的路程 越多，故小分子最后流出柱外，而大分子先从柱中流出。一些中 等大小的分子介于大分子与小分子之间，只能进入一部分凝胶较 大的孔隙，亦即部分排阻，因此这些分子从柱中流出的顺序也介 于大、小分子之间。这样样品经过凝胶层析后，分子便按照从大 到小的顺序依次流出，达到分离的目的。 凝胶层析载体 ? 用作凝胶的载体物质有交联葡聚糖、聚丙烯酰胺和琼脂 糖等。使用最多的是交联葡聚糖。 ? 交联葡聚糖的商品名为 Sephadex, 是由链状葡聚糖通过交 联剂 1 — 氯代 — 2 ， 3 — 环氧丙烷交联而成。交联剂添加越 多，孔径越小，吸水量也越小；反之越大。以 G-x 表示型 号，后面的数字可以看出交联度，数字越小，胶联度越 大。 ? SephadexG-25 粗：吸水量 2.5ml/g ，干粒子直径 100- 300 μ m ，筛孔 40-60 。大部分蛋白质分子从外水体积流 出，盐等小分子从内水体积流出。 实验一 卵球蛋白的盐析分离 0.7ml 卵清 + 0.7ml 饱和硫酸铵溶液 （每组 2 个 EP 管） 混合均匀 （避免产生气泡） 静置 3-5 分钟，蛋白质析出 3000rpm ，离心 3 分钟 用移液枪去除上清（含卵清蛋白） 1.0ml 水 充分 溶解 卵球蛋白沉淀 3000rpm, 离心 3 分钟 将两管上清合并， 即为样品 加 50% 硫酸铵溶液 1.5ml 洗涤 3000rpm ，离心 3 分钟 用移液枪去除上清 实验步骤（二）卵球蛋白的脱盐 安装：固定层析柱，安装排水管、止水夹和螺旋夹 排气 泡？ 准备凝胶悬 液？ 装柱：将准备好的凝胶悬液一次性装入层析柱中，同时打开下端的 止水夹，调节流速（ 1d/5sec ）。要求柱高 25cm 左右。要求 ？ 平衡 上样？ 收集： 1.5ml/ 离心管，上样后立即开始收集 测定吸收值和硫酸根离子：取 样品 1ml 加入 2ml 蒸馏水 稀释， 先测定吸收值，然后去适量测定硫酸根离子，记录。 注意事项 ? 实验完毕后，将 凝胶全部回收 处理，以备下次实验使用， 严禁将凝胶丢弃或倒入水池中。 ? 样品溶液的浓度大一些好，但粘度不宜大，加样体积通