16重组dna技术与蛋白质工程1.ppt

限制酶切位点 限制酶消化 除去中间片段 cos L R cos cos L 左臂 R cos 右臂 真核生物染 色体 DNA 限制酶部分消化 外源 DNA 与载体 DNA 混合 连接反应 体外包装 用重组噬菌体 感染大肠杆菌 ~20 Kb DNA 片段 cos L R cos ~20 Kb 外源 DNA 片段 基因文库 mRNA cDNA 双链 cDNA 重组 DNA 分子 cDNA 文库 反转录酶 载体 受体菌 复制 3. cDNA 文库 逆转录酶 A A A A T T T T AAAA SI 核酸酶 DNA 聚合酶Ⅰ 碱水解 T T T T DNA 序列是已知的，或两端已知，可以利 用选择性体外扩增 DNA 的方法 —— PCR 。 是一种在体外利用酶促反应大量获得特异 序列的基因组 DNA 或 cDNA 的专门技术，又称 为无细胞的分子克隆。 4. 聚合酶链反应（ PCR ） 模板 DNA 引物 4 种 dNTP Taq DNA 聚合酶 含 Mg 2+ 的缓冲液。 PCR 的反应体系 （ 1 ） 变性 ，加热至 95 ℃ ，使模板 DNA 解开成单链； （ 2 ） 退火 ，温度降至适宜，使引物与模板互补结合； （ 3 ） 延伸 ，温度升至 72 ℃ ， DNA 聚合酶以 4 种 dNTP 为底物，在引物的 3' -OH 上，合成与模板互补的 DNA 新链。 PCR 的基本反应步骤及原理 PCR 反应条件 变性 95 ? C 延伸 72 ? C 退火 Tm-5 ? C Tm 指的是把 DNA 的双螺旋结 构降解一半时的 温度 PCR 反应的基本原理 （三）外源基因与载体的连接 1. 粘性末端连接 方式： (1) 同一限制酶切位点连接 (2) 不同限制酶切位点连接 （二）克隆载体的选择和构建 Bam H Ⅰ 切割反应 GGATCC CCTAGG T4 DNA 连接酶 15o C GATCC G G CCTAG + 目的基因用 Bam H Ⅰ切割 G CCTAG G CCTAG GATCC G GATCC G 载体 DNA 用 Bam H Ⅰ 切割 G CCTAG G CCTAG GATCC G GATCC G 重组体 G CCTAG G CCTAG GATCC G GATCC G G CCTAG G CCTAG GATCC G GATCC G 载体自连 目的基因自连 同 一 限 制 酶 切 位 点 连 接 不同限制酶切位点的连接 GAATTC CTTAAG AGATCT TCTAGA Eco R Ⅰ 切割位点 G CTTAA A TCTAG AATTC G GATCT A Bg l Ⅱ 切割位点 AATTC G A TCTAG AATTC G GATCT A AATTC G A TCTAG + Eco R Ⅰ + Bg l Ⅱ 双酶切 Eco R Ⅰ + Bg l Ⅱ 双酶切 G CTTAA A TCTAG AATTC G GATCT A T4 DNA 连接酶 15o C 重组体 配伍末端的 连接情况和同一 限制酶切位点连 接相似。 2. 平端连接 适用于： 限制性内切酶切割产生的平端 粘端补齐或切平形成的平端 目的基因 载体 限制性内切酶 限制性内切酶 T4 DNA 连接酶 15o C 重组体 载体自连 目的基因 自连 3. 同聚物加尾连接 在末端转移酶 (terminal transferase) 的作用下，在 DNA 片段末端加上同聚物序 列、制造出粘性末端，再进行粘端连接。 5 ′ 3 ′ 3 ′ 5 ′ 载体 DNA 5 ′ 3 ′ 3 ′ 5 ′ 目的基因 限制酶或机械剪切 限制酶 5 ′ 3 ′ 3 ′ 5 ′ 5 ′ 3 ′ T(T) n T T(T) n T 3 ′ 5 ′ 5 ′ 3 ′