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细菌的分离与培养 实验日的： 掌握在各种培养基上的接种方法并观察生长现象。 实验材料： 菌种、普通琼脂平板、肉汤培养基、半固体培养基、斜面培养基、接种环、接种针、洒精灯。 实验内容： 一、 平板划线接种法（分离培养法） 原理：通过在平板上划线，将混杂的细菌在琼脂平板表面充分的分散开，使单个细菌能固定在一 点上生长繁殖，形成单个菌落，以达到分离纯种的日的。若需从平板上获収纯种，则挑取一个单 个菌落作纯培养。 用途：分离出纯种细菌，以利作纯培养。 课时安排：2课吋 操作方法（三区划线法）： 1、 右手拿接种环，烧灼冷却后，収菌液一环。 2、 左手抓握琼脂平板（让皿盖留于桌上），在酒精灯火焰左前上方，使平板面向火焰，以免空 中杂菌落入，右于将已沾菌的接种环在琼脂表面密集而不重叠的来冋划线，面积约占整个平板的 1/5-1/6,此为第一区。划线时接种环与琼脂呈30?40度角轻轻接触，利用腕力滑动，切忌划 破琼脂。 3、 接种环上多余的细菌可烧灼（每划完一个区域是否需耍烧灼灭菌视标本中含菌量多少而定）， 待冷后，在划线末端重复根线后，再划下一区域（约占1/4面积），此为第二区。 4、 第二区划完后可不烧灼接种环，用同样方法划第三区，划满整个平皿。 5、 划线完毕，将平板扣入皿盖并作好标记，置37C温箱孵育18-24小时观察琼脂表面菌落分 布情况，注意是否分离出单个菌落，并记录菌落特征（如大小、形状、透明度、色索等）。 二、 液体培养基接种法 用途：凡肉汤、蛋白豚水，各种单糖发酵均用此法接种。可以观察细菌不同的生长性状、生化特 性以供鉴别之用。 操作方法： 右手执笔式握住接种环，灭菌冷却后取单个菌落。 1、 左手抑指、食指、中指托住液体培养基之下端，右手小指和无名指（或手掌）拔取试管塞, 将管口移至火焰上旋转烧灼。 2、 将沾菌的接种环移入培养棊管中，在液体偏少侧接近液ifii的管壁上轻轻硏磨，沾収少许液 体与之调和，使菌液混合于培养基中（图5）。 3、 管口通过火焰，塞好试管塞，将接种环灭菌后放下，经37°C温箱孵育18-24小时，取出 观察生长情况。 三、 半固体穿刺接种法 用途：观察细菌动力，保存菌种。方法： 1、 以无菌操作用接种针挑収单个菌落，立即垂宜插入培养棊中心至接近管底处循原路退冋。 2、 管口通过火焰，塞上棉塞，接种针灭菌后放下。试管置37°C温箱孵育18-24小时，取出后 对光观察穿刺线上细菌生长情况：细菌有无向周围扩散生长，穿刺线是否清晰等。 图5液体（左）及半固体（右）培养基接种法 四、 斜面培养基接种法 用途：常用于扩人纯种细菌及实验室保存菌种。 操作方法： 1、 以无菌操作法用接种环挑収单个菌落，口斜ifii底向上划一直线，然后再从底向上轻轻来冋 作蜿蜒划线。 2、 管口通过火焰，塞上棉塞，接种环烧灼后方可放下。置37°C温箱孵育18-24小时，収出 观察斜面上菌苔生长情况。 细菌分离培养及移植 在细菌学诊断屮，分离培养是不可缺少的一环。分离培养的冃的主要是在含多种 细菌的病料或培养物屮挑选出某种细菌。在分离培养吋应注意：选择适合于所分 离细菌生长的培养基、培养温度、气体条件等。同时应严格按无菌操作程序进行 实验，并做好标记。 ［H的要求］ （1） 掌握细菌分离培养的基本要领和方法。 （2） 掌握厌氧菌培养的原理及其方法。 ［实验材料］ 菌种：大肠杆菌斜面、大肠杆菌与金黄色葡萄球菌混合培养肉汤等。 器械：剪刀、记号笔（以上小组共用）。 培养基：普通肉汤和普通琼脂斜面、普通琼脂和鲜血琼脂平板、酒精灯、接种环 （以上每人一套）。 ［需氧性细菌分离培养法］ 划线分离培养法此法为常用的细菌分离培养法。平板划线培养的方法甚多， 可按各人的习惯选择应用，其FI的都是达到使被检材料适肖的稀释，以求获得独 立单在的菌落，防止发育成菌苔，以致不易鉴别其菌落性状。划线培养时须注意 以下几点： 左手持皿，用左手的拇指、食指及 屮指将皿盖揭开呈20。左右的角度(角度愈小愈好，以免空气屮的细菌进入皿屮 将培养基污染)。 右手持接种环，从大肠杆菌与金黄色葡萄球菌混合培养肉汤屮取少许材料涂 布于培养基边缘，然后将接种环上多余的材料在火焰屮烧毁，待接种环冷却后, 再与所涂材料的地方轻轻接触，开始划线，方法如图(5-1) o 划线前先将接种环稍稍弯曲，这样易和平皿内琼脂面平行，不致划破培养基。 田手删■法 划线屮不宜过多地重复I口线，以免形成 菌苔。 接种完毕，在皿底上作好菌名、日期和接种者等标记，平皿倒扣，置37°C培 养。 纯培养的获得与移植法将划线分离培养37°C24h的平板从温箱取出，挑取单 个菌落，经染色镜检，证明不含杂菌，此时用接种环挑取单个菌落，移植于琼脂 斜面培养，得到的培养物，即为纯培养物，再作其他各项试验检查和致病性试验 等