Real-time PCR实时技术讲解.pptVIP

Real-time PCR Introduction to Real-time PCR 迄今最灵敏最准确的核酸定量检测技术 Classical PCR-end point analysis Real-Time PCR Chemistries 对样品中目的基因的初始量的多少进行定量检测 反应体系中引入荧光素 — 每种荧光素都有一个最适激发光波长和发射光波长 荧光信号的强度增长与扩增产物的积累成正比 实时监测荧光信号 Real-Time PCR Chemistries Real-Time Chemistry: SYBR Green I SYBR Green I 与dsDNA结合 SGI 与dsDNA结合后受激发荧光强度增加1000倍. Real-Time Chemistry: SYBR Green I Real-Time Chemistry: SYBR Green I Melting Curve Analysis using SYBR Green 样品温度升高，dsDNA变性释放出SGI，使得体系中荧光信号减弱。 温度到达产物Tm时，荧光减弱最快。 Melting Curve Analysis using SYBR Green 荧光值变化率为纵坐标，温度为横坐标作图，得到一个波峰，对应温度为Tm. Melting Curve Analysis Real-Time Chemistry: SYBR Green I 优点 仅需要一对引物，实验设计简单。 PCR扩增后可进行产物的熔解曲线分析，以确定特异性。 实验成本低。 具有通用性 不足 特异性仅由引物保证。 非特异性双链DNA也会产生荧光信号。 不能用于多重Real-Time PCR。 Real-time Chemistry TaqMan? 模板目标序列特异结合的水解探针 5’ 标记荧光报告基团， 3’末端标记淬灭基团 利用荧光共振能量转移( FRET )原理 Real-time Chemistry TaqMan Probe Real-time Chemistry TaqMan Probe Real-time Chemistry TaqMan Probe Real-time Chemistry TaqMan Probe 优点 高度的检测特异性 信噪比高 可用于多重Real-Time PCR 不足 探针合成成本高 通用性不好 Real-time Chemistry Molecular beacons Real-time Chemistry FRET Probe PCR: Theory vs. Reality 产物持续增加直到平台期 Real-time PCR 在指数期线性范围内进行荧光检测. Cycle Threshold or C(t) C(t) Analysis 初始模板量的对数与Ct值之间存在反比线性关系 较高的初始模板浓度有较低的C(t). C(t) Analysis 初始模板浓度相差2倍，Ct值相差1个循环 C(t) Analysis 初始模板量相差10倍，Ct值相差3.32个循环. Real-Time PCR data analysis Real-Time PCR Theory Real-Time PCR data analysis Real-Time PCR data analysis Real-Time PCR data analysis Real-Time PCR data analysis The factors affect Real time-PCR 模板、引物（及探针）的设计筛选 反应液成分和反应程序 实验操作技术 The factors affect Real time-PCR Getting started Primer and Amplicon Design 引物GC含量在50～60％ 引物Tm在50～65℃ 引物的位置避开目标序列上的二级结构 避免G或C重复3次 将G或C置于引物末端’ 避免引物3末端互补 避免二级结构 在NCBI数据库进行比对,确保特异性 产物长度在75～200bp之间 产物避免二级结构 产物避免有多于4个的单个碱基重复 跨内含子设计引物，避免基因组DNA的影响 Amplicon Secondary Structures Bad location for primers Primer Location Primer-Dimers 引物二聚体会使SGI与之结合，导致Ct值偏小. 引物二聚体的扩增会减小PCR效率. 特异性和重复性差 探针退火温度应比引物高5