实验八实验九.docxVIP

PAGE PAGE # 大肠杆菌感受态细胞制备与转化 为了提高转化效率 , 实验中要考虑以下几个重要因素： 细胞生长状态和密度：不要用经过多次转接或储于4C的培养菌，最好从— 70C或-20 C甘油保存 的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。细胞生长密度以刚进入对数生长期时为好，可通过监测培 养液的OD600来控制。DHa 菌株的OD600为0.5时，细胞密度在5X107个/ml左右（不同的菌株情况有 所不同 ）, 这时比较合适。密度过高或不足均会影响转化效率。 质粒的质量和浓度 ： 用于转化的质粒 DNA 应主要是超螺旋态 DNA（cccDNA） 。转化效率与外源 DNA 的浓度在一定范围内成正比，但当加入的外源DNA的量过多或体积过大时，转化效率就会降低。1ng的 cccDNA即可使50卩的感受态细胞达到饱和。一般情况下，DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的 5%。 试剂的质量：所用的试剂，如CaCI2等均需是最高纯度的（GR.或AR.）,并用超纯水配制，最好分装保 存于干燥的冷暗处。 防止杂菌和杂 DNA 的污染： 整个操作过程均应在无菌条件下进行 ， 所用器皿 ， 如离心管 ， tip 头等 最好是新的 ，并经高压灭菌处理 ，所有的试剂都要灭菌 ，且注意防止被其它试剂、 DNA 酶或杂 DNA 所污染， 否 则均会影响转化效率或杂 DNA 的转入， 为以后