常州地区猪传染性胃肠炎和呼吸道冠状病毒病血清学调查.doc

PAGE PAGE 1 来源网络整理，仅供学习参考 常州地区猪传染性胃肠炎和呼吸道冠状病毒病血清学调查 罗坚强柴文娴王姣奚德华 常州市动物疫病预防控制中心，江苏常州213002 传染性胃肠炎(TGE)是一种高度传染性病毒性肠道疾病，其特征为引起2周龄以下仔猪呕吐、严重腹泻和高死亡率（通常100%）。20世纪80年代，能感染呼吸系统的TGE病毒基因缺失变异株，即猪呼吸道冠状病毒(PRCV)出现并广泛流行，由于两者存在共同的抗原位点，PRCV改变了TGEV临床传播和发病状况。TGEV和PRCV对各年龄段的猪都易感，但TGEV对超过5周龄的猪群死亡率很低，而PRCV-般呈亚临床感染。 由于TEGV和PRCV存在抗体交叉反应，猪体内的PRCV的感染抗体可中和TEGV病毒，同时也干扰了用血清学方法诊断和鉴别TGFV和PRCV感染”。对于TGEV和PRCV阴性的猪场，一旦发生TGEV，就会造成很大的损失；而对于PRCV阳性的猪场，则可能形成各年龄段猪TGEV温和型发病，掩盖了TGEV的感染。本调查使用TECV和PRCV抗体鉴别试剂盒，试图了解本地区生猪TECV和PRCV感染情况。 1试验材料 1)样品：采自养殖场、屠宰场猪血清共308份，其中规模养猪场（存栏≥500头）109份，散养户(存栏lt;500头)89份，养殖场采样群生猪日龄在60~90d之间。屠宰场样品来自本市3个屠宰场的10批待宰猪，其中来源地为本市养殖场的50份，来源地为外省养殖场的的60份。 2)试剂：INGENASATGEV和PRCV抗体鉴别ELISA试剂盒，购自某公司，批号：280113。 3)仪器设备：Bi0680酶标仪，Eppendorf移液器一套，Tecan洗板机等。 2试验方法 对所有样品用ELISA方法检测TGEV和PRCV抗体。 2.1操作过程 所有试剂和待检血清检测前恢复到室温(18~25℃)；25倍稀释洗涤液；每孔加样品稀释液50μL；A1、A2孔加PRCV阳性对照血清50μL，Bl、B2孔加TGEV阳性对照血清50μL，Cl、C2、Dl、D2孔加阴性对照血清50μL;待检样品每个样加并排两个孔，如第1个样为El、E2，第2个样为Fl、F2，依此类推；封板，37℃孵育1h；洗板3次；将酶结合物A加到板上的奇数排，酶结合物B加到板上的偶数排；37℃孵育30min；洗板6次；每孔加入100μL底物，暗室室温放置10min；每孔加入100μL终止液，5min内酶标仪450nm波长读数。 2.2试验有效性判断 本试剂盒要求符合以下条件：TGEV阳性对照酶结合物A孔OD值lt;0.3，酶结合物B孔OD值lt;0.3；PRCV阳性对照酶结合物A孔OD值lt;0.3，酶结合物B孔OD值0.7；阴性对照酶结合物A孔OD值1.0，酶结合物B孔OD值1.0。 2.3临界值(cutoff)的计算 PRCV阴性，阳性临界值cutoff(1)=0.6×阴性对照在酶结合物A孔的OD值；TGEV阳性临界值cutoff(2)=0.6×PRCV阳性对照在酶结合物B孔的OD值；TGEV阴性临界值cutoff(3)=0.6×PRCV阳性对照在酶结合物B孔的OD值。 2.4结果判定 分2步：第1步，如果样品在酶结合物A孔的OD值高于cutoff(l)，则该样品TGEV和PRCV均为阴性，其他样品进入第2步判定。第2步，如果样品在酶结合物B孔的OD值低于cutoff(2)，则判定为TGEV阳性；高于cutoff(3)，则判定为PRCV阳性；在cutoff(2)和cutoff(3)之间，则判为可疑样品。 3结果 1)来自养殖场和屠宰场的共308份血清，经ELISA方法检测其TGEV和PRCV抗体，结果见表1。根据表1结果可知，共检出TGEV阳性样品9份，全部来自同一养殖场；检出PRCV抗体阳性样品86份，规模养殖场、散养户、屠宰场均有阳性样品检出。TGEV抗体阳性率为2.92%，PRCV抗体阳性率为27.92%。 2)TGEV和PRCV阳性场和批次统计见表2。由表2可知，没有检出仅TGEV阳性的场或批次；仅PRCV阳性的场和批次中，规模场比例最少(1/8)，散养场其次(4/7)，屠宰场本地和外地猪均为50%；有1个规模养殖场同时感染TGEV和PRCV。 4讨论 TGEV与PRCV抗原关系密切，产生的抗体存在交叉反应，常规的血清学检测方法难以鉴别。但PRCV的S蛋白存在1或2个抗原位点的缺失，所以，使用针对PRCV的S缺失区的抗原位点的单克隆抗体建立的阻断ELISA，可从血清学上区分PRCV和TGEV感染猪。本检测试剂盒中，酶结合物A含有两个病毒共同保守位点的酶标单抗，只要感染了任何一种病毒的猪血清都会阻断其与包被的病毒蛋白结合；而酶结合物B只含有针对TGEV特有位点的酶标单抗，只有含TG