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流式细胞仪免疫分型手册 流式细胞仪免疫分型手册 Immunophenotyping handbook （草稿·2006-2-19 殷跃锋收集整理 苏州工业园区跃亚生物技术有限公司 目录 正常骨髓细胞分布及幼稚细胞出现位置 正常B细胞抗原表达及其变化 正常单核细胞抗原表达及其变化， 正常粒细胞抗原表达及其变化 正常红细胞抗原表达及其变化 白血病淋巴瘤样本制备 免疫分型抗体配伍 急性髓细胞白血病免疫分型总论 M1 M2 M3 M4 M5 M6 M7 急性B淋巴细胞白血病免疫分型 急性T淋巴细胞白血病免疫分型 慢性淋巴细胞白血病 非霍奇金淋巴瘤免疫分型 MICM血液肿瘤计算机辅助判断系统 正常骨髓免疫分型 左图是正常骨髓经CD45、CD71、CD33染色后组成的CD45/SSC、CD71/CD33双参数散点图；通过这两个组合，能够分辨骨髓的正常细胞、检查是否有异常细胞存在、评估细胞的成熟情况。 CD45/SSC图中可见： 1，CD45强阳性SSC低信号的细胞群为淋巴细胞（褐色细胞群体）； 2，中等强度的CD45表达，SSC信号最强的细胞群体为粒细胞（蓝色及红色细胞群体）； 3，CD45表达与SSC信号介于淋巴细胞与粒细胞之间的是单核细胞群体（绿色细胞群体）； 4，CD45阴性，SSC信号最低的有核红细胞和细胞碎片； CD33/CD71图中可见： 1，CD33表达最强的单核细胞群体（绿色）； 2，粒细胞CD33表达较单核弱，不成熟粒表达CD71，成熟后不表达。 3，淋巴细胞、有核细胞和细胞碎片不表达CD33、CD13。 CD11B/CD15图可用来评估髓系细胞向单核、粒分化的程度（随着髓细胞成熟，细胞逐步获得CD11B，粒细胞高表达CD15）： 1，单核细胞（绿色）高表达CD11B，CD15中等到表达； 2，粒细胞（蓝色及橘红色）高表达CD15，蓝色成熟粒CD11B表达较橘红色不成熟粒细胞强，幼稚髓细胞仅表达CD15而无CD11B。 3，T、B淋巴细胞不表达CD15、CD11B，NK细胞表达CD11B而无CD15（红色细胞）。 4，有核红细胞及碎片不表达CD15和CD11B。 根据骨髓细胞CD45/SSC图中分布情况设门圈定各类细胞： R1门为成熟淋巴细胞； R2门为正常单核细胞位置； R3门正常粒细胞位置； R4门为幼稚淋巴细胞出现位置； R5门为有核红细胞或细胞碎片位置； R6门为幼稚髓细胞出现位置； 白血病细胞通常会在R4、R6两门位置处出现。 不同年龄正常骨髓B细胞分化成熟过程及流式分析图谱 图1A-F B细胞流式染色方案：1，TdT/CD20/CD19/CD10。联合B细胞标志物CD19，抗体组合CD10和CD20可对B细胞分化程度做出分析。分析CD19阳性的B细胞，通过CD10和CD20的表达情况至少可将B细胞划分归入四个分化阶段，如图A所示I-IV。随着细胞分化成熟将逐渐失去CD10而表达CD20，所以四个不同分化阶段的细胞已连续的方式分布CD10/CD20散点图上（图D）。 如果存在浆细胞的话，在这个图谱上分布有结特殊，它是CD10阴性并CD20阴性。因为在B细胞分化过程中CD10和CD20抗原表达差异很大，所以使用APC或PE标记的抗体来区分不同的表达水平（这两种荧光有很好的信噪比）。在CD10/CD20组合中加入TdT抗体能更详细地描绘CD10阳性且TdT阳性的不成熟B细胞，越是成熟的CD10+B细胞，TdT表达越弱。因为检测TdT涉及胞浆内染色，所以TdT染色会增加实验的复杂度，但通过它却可对CD10+阳性的不成熟B细胞作出进一步区分，因而意义重大。首先我们可通过TdT/CD10识别TdT弱阳性/CD10强阳性的前B白血病细胞；其次通过TdT+/CD10+细胞和TdT-/CD10+的比值可评估骨髓生成情况（如药物诱导）。 2，CD45/CD34/CD19/CD22。第二个四色抗体组合的CD34、CD22、CD45和CD19。通过这组抗体同样也可将CD19阳性的B细胞分为四个分化阶段（图A中的I-IV）。前一组染色识别的最不成熟的B细胞在此对应于CD34+/CD22+/CD45弱阳性群体（如图E、F）。随着CD22的表达增加，B细胞开始成熟并逐渐增多表达CD45（如图F）。前组染色中成熟的CD10-/CD20+B细胞在此对应于在CD22/CD45散点图中的CD22强阳性/CD45强阳性的群体。某些情况下在还可见到少数CD22+/CD19-/CD34+群体，它们被定义为四个B细胞分化阶段之前的B祖细胞。当流式细胞仪经过校准标准化后，使用同样克隆的抗体及染色方法，各个分化阶段的细胞在散点图上的位置是相对稳定的。 如果各细胞群体的数量或是位置在散点中有改变则应视为（异常）正常的变异或是B细胞分化过程出现的异常情况。