基膜粘连蛋白和IV型胶原对培养脊髓神经细胞突起生长的作用.docxVIP

文档收集于互联网，已重新整理排版 文档收集于互联网，已重新整理排版.word版本可编借，有帮助欢迎下载支持. 1 1文档来源为:从网络收集整理.word版本可编借. 聚赖氨酸的培养板为对照，将培养的脊髓细胞以相同浓度加入各组培 养板内?培养5 d后将各组细胞进行神经元特异性烯醇化酶（NSE）免 疫组化染色，利用计算机图像分析技术测定各组神经元突起的长度并 进行统计学分析.结果：免疫组化染色可见各组均有较多的神经细胞 及其突起生长，统计分析结果表明基膜粘连蛋白组与IV型胶原组间神 经元突起生长长度无显著差异，基膜粘连蛋白组神经元突起生长长度 长于其它各组? IV型胶原组神经元轴突生长长度与I型胶原组间无显 著差异，与多聚赖氨酸组有显著性差异.基膜粘连蛋白组和IV型胶原组 神经元轴突生长情况优于相应的抗体组.结论：基膜粘连蛋白和IV型 胶原均可促进脊髓神经元突起的生长. 【关键词】层粘连蛋口;胶原;神经元 0引言 细胞外基质成分能够促进神经细胞轴突的生长和髓鞘的形成 .基膜粘连蛋口和IV型胶原是细胞外基质的重要组成成分，对神 经细胞的生长、发育等方而起着重要的作用[2, 3].在动物实验研究 中我们观察到该两种物质能够促进周围神经的再生[4],为进一步了 解它们对神经细胞突起生长的直接作用，我们从形态学上观察了基膜 粘连蛋白和IV型胶原对培养条件下脊髓神经细胞突起生长的作用. 1材料和方法 1实验分组 实验分为6组：基膜粘连蛋口组（LN组）， 抗基膜粘连蛋白组（antiLN组），IV型胶原组（Col IV组），抗IV型胶 原组（antiCol IV组），I型胶原组（Col I组），多聚赖氨酸组（poly 组）. 各组用相应的底物包被培养板?①LN组：按1 g#12539;cm-2的量将基膜粘连蛋白（GIBCO/BRL）均匀地涂于培养板 上.②AntiLN组：于包被好的LN组培养板内加入抗基膜粘连蛋白单 克隆抗体（北京中山生物技术有限公司），工作浓度1 ： 2000, 37°C孵 育过夜.③Col IV组：按1 Ug#12539;cm-2的量将IV型胶原蛋白 （GIBC0/BRL）均匀地涂于培养板上.④AntiCol IV组：于包被好的 Col IV组培养板内加入抗IV型胶原蛋白单克隆抗体（北京中山生物技 术有限公司）,工作浓度1 : 2000, 37°C孵育过夜.⑤Col I组：按1 H g#12539;cm-2的量将I型胶原蛋白（Sigma）均匀地涂于培养板上. ⑥Poly组：将浓度为20 H g#12539;mL-l的多聚赖氨酸（Sigma） 均匀地涂于培养板上. 将以上各组培养板放置于37°C孵箱内24 h备用. 1. 2脊髓细胞分组培养无菌条件下切取胎龄为18 d的昆明 小鼠脊髓，参考杨大莉等［5］报道的方法进行细胞培养，于解剖显微 镜下小心剥离脊髓，剥净血膜，剪碎组织至1 mmX 1 mmX 1 mm, 125 g#12539;L-l 胰酶（Sigma）消化，37°C, 25 min.用完全培养液（DMEM 含胎牛血清、马血清各100 mL#12539;L-l, Sigma）终止消化10 min. 用N1培养液（DF12培养液中含胰岛素5 mg#12539;L-1、转铁蛋白5 u g#12539;L-l、硒 酸钠 5 u g#12539;L-l、黄体酮 002 mniol#12539;L-l）洗组织，吹打制成单细胞悬液，以2 X 105 #12539;mL-l的密度分别接种于24孔各组培养板内，每孔的悬液量 为05 mL.静置培养48 h,换用马血清培养液(Sigma),加入阿糖胞苜 (Arae Sigma),浓度 10 U mol#12539;L~1,作用 24 h,抑制胶质细 胞的生长.第5日时终止培养,PBS洗去培养液，加入40 g#12539;L-l 多聚甲醛，4°C固定2 h, PBS洗3遍后加入80 g#12539;L-l蔗糖液 保存标本. 3免疫组织化学染色 将固定的标木用PBS洗3遍，每遍 3 min, 30 mL#12539;L-1甲醇双氧水封闭内源性过氧化酶的活性15 min, PBS洗3遍，1/50正常羊血清孵育20 min,加入神经元特异性 烯醇化酶抗体(NSE 1 : 500 Sigma) 4°C孵育48 h, PBS洗3遍;加入 生物素化的第二抗体(马抗兔IgG 1 : 200), 4°C孵育24 h； PBS洗3 遍，加ABC复合物4°C 4 h； PBS洗3遍，DBAH202液显色；PBS洗3 遍，甘油明胶液封存标木. 1.4突起长度的测量各组染色后的标木置于CANERA LUCIDA 绘图显微镜下绘出染色阳性的胞体和突起的形状，每组3份标木.所绘 制的细胞图要求胞体及突起与其他的胞体和突