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PCR引物设计及软件使用技巧 张新宇，咼燕宁3 (中国协和医科大学中国医学科学院肿瘤研究所 ，北京100021 摘要:介绍了使用软件设计PCR引物的技巧。在PCR引物设计原则的基础上， 详细介绍了两种常用引物设计软件的基本使用方法 ，并对其各自的优缺点进行了比 较。一般性引物自动搜索可采用 “ Premier Primer 5软牛，而引物的评价分析则可采 用 “Oli 2 g o6软件。 关键词:PCR 引物设计;软件 中图分类号：Q524 文献标识码:B 文章编号：1672-5565(2004-04-0015-04 收稿日期:2003-10-09修回日期:2004-06-10 作者简介：张新宇(1972-,男山西中阳人，硕士,副研究员，研究方向：生物信息学。 T el :010E -mail :xyzh @263.net.cn 3通讯作者：高燕宁,研究员,T el :010-E -mail :yn gao @qubem.cicams.ac.cn To desig n PCR primers with Oligo 6and Primer Premier 5 ZHANG X in -yu ,G AO Y an -ning (Cancer Institute ,Chinese Academy o f Medical Sciences ,Beijing ,100021,China Abstract :The skill of PCR primer desig n with s oftware is in troduced in this paper.Based on the principle of PCR -primer design ,the usage of tw o kinds of popular primer -desig n s oftware was reviewed detailedly ,in cludi ng their merit ,demerit and usage skills .It is recomme nded to use Premier Primer 5for the usual automatic primers search ,but Olig o 6primers an alysis. K ey w ords :PCR primer ;desig n ;usage skill ;s oftware 自从1985年K arnyMullis发明了聚合酶链式反应（PCR以来,PCR技术已 成为分子生物学研究中使用最多、最广泛的手段之一 [1],而引物设计是PCR技术 中至关重要的一环。使用不合适的 PCR引物容易导 致实验失败：表现为扩增出目的带之外的多条带（如 形成引物二聚体带，不出带或出带很弱，等等。 现在PCR引物设计大都通过计算机软件进行。可以直接提交模板序列到特定 网页，得到设计好的引 物，也可以在本地计算机上运行引物设计专业软件。一般来说 ，专门进行PCR引 物设计的专业软件功能更 为强大，但使用起来却不太容易。本文将就引物设计 原则及软件使用问题进行探讨。 1引物设计的原则 引物设计有3条基本原则:首先引物与模板的 序列要紧密互补；其次引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构；再次 引物不能在模板的非 目的位点引发DNA聚合反应（即错配。 具体实现这3条基本原则需要考虑到诸多因素，如引物长度（primer length，产物 长度（product length，序列T m值（melting tem perature 引物与模板形成双链的内部稳定性 （internal stability ,用△ G值反映，形成引物二聚体（primer dimer及发夹结构（du 2plex formation and hairpin的能值，在错配位点（false priming site的引发效率,引物及产物的 G C含量 （com position，等等。必要时还需对引物进行修饰,如增加限制性内切酶位点，引 进突变等。根据有关 参考资料和笔者在实践中的总结，引物设计应注意如下要点:（1引物的长度一般 为15~30bp，常用的是18~27bp但不应大于38bp，因为过长会导致其延伸温度大于 74C,不适于T aq DNA聚合酶进行反应［2］。（2引物序列在模板内应当没有较高相 似性片段，尤其是3端相似性较高的序列，否则容易导致错配。引物3端出现3个以 上的连续碱基，如GGG或CCC也会使错误引发机率增加［2］。（3引物3端的末位碱 基对T aq酶的DNA合成效率有较大的影响。不同的末位碱基在错配位置导 生物信息学 China Journal of Bioi