叶部病害分离解读.ppt

实验三 叶部病原真菌 的分离、培养、纯化 柯氏准则： 1. 这种微生物经常与某种病害有联系，发生这种病害往 往就有这种微生物的存在； 2. 从病组织上可以分离到这种微生物的纯培养，并且可 以在各种培养基上研究它的性状； 3. 将培养的菌种接种在健全的寄主上，可诱发与原来相 同的病害； 4. 从接种后发病的植物上，能再分离到原来的微生物。 一、实验目的 1. 为了证实其病原菌的特性； 2. 为了进一步研究病原菌的形态、生活史、生理和生态特性； 3. 为了获得其发酵液等 鉴于以上原因，分离和纯化真菌是必需的，是保证整个实 验能够顺利进行的前提。 二、实验原理 真菌的分离就是将所需要的真菌与其他杂菌分开，供给适 当的条件，使它们繁殖而得到纯培养。 为了获得某微生物的纯培养，一般是根据该微生物对营养、 酸碱度、氧气等条件要求不同，而供给它们适宜的生活条件， 即让病原菌生活在适宜的培养基上，或加入某种抑制剂造成只 利于此菌生长，而抑制其他菌生长的环境，从而得到纯培养菌 株。 三、实验步骤 1. 分离前的准备工作 （ 1 ）工作台的灭菌 （ 2 ）培养基的准备 （ 3 ）操作人员的清洁 （ 4 ）分离所需用具的消毒与灭菌 培养皿、小烧杯、接种针、酒精灯、解剖刀、剪刀、 纱布、记号笔、镊子、酒精、培养基、 表面消毒液 2. 分离材料的选择 （ 1 ）必需是新鲜发病的植株、器官或组织 （ 2 ）选择的组织必需是病健交界的部位 原因：主要是尽量减少腐生菌的污染 3. 组织的表面消毒 （ 1 ）升汞溶液：一般用 0.1 ％的升汞溶液；升汞表面消毒所需 的时间因材料不同，处理的时间可自 30s － 30min 不等，通常为 3 － 5min 。（现在不用） （ 2 ）次氯酸钠：所用的浓度一般每一次使用的是 3 ％－ 5 ％的 水溶液，消毒时间为 5 － 15min 。 （ 3 ）酒精：常用浓度 70 ％酒精。消毒时间一般很短，只有几 秒钟至 1min 。 4. 一般分离方法 病原真菌种类繁多，其分离的方法不同，而同一种材料 又可用不同的方法分离。常用的方法可分为两大类，即组织 分离和稀释分离法。 （ 1 ）组织分离法 植物病原真菌（尤其是叶部病害）的分离一般都是用组 织分离法，即就是切取小块病组织，经表面消毒和无菌水洗 过之后，移在培养基平板上培养。 注意事项： ① 组织大小要适宜，一般为 4 － 5mm 的小块。 ② 切取的组织块必需是病健交界的部位。 ③ 要掌握消毒时间的长短。 （ 2 ）稀释分离法 植物病原真菌的分离一般很少用稀释法分离，但对于一些 产孢子量极大的病原真菌和霉菌，可以配制成孢子悬浮液进行 稀释分离。 具体步骤：将寄主组织受害部分的孢子洗下配成悬浮液， 经稀释后与熔化并冷却到 45 度左右的培养基混合，然后倒在灭 菌的培养皿中。 注意事项： ① 待分离组织必需是新鲜发病的。 ② 要掌握培养基的温度。 ③ 要掌握孢子悬浮液的浓度。 （ 3 ）细菌污染的排除 在分离过程中，由于细菌生长繁殖速度快于真菌，是获得病原真菌纯培 养最大的障碍。因此，在分离过程中，常采用一些方法来抑制细菌的生长， 从而保证能够获得目的菌株。 ① 将培养基调节到酸性反应，在 100mL 培养基中加 3 滴 25 ％的乳酸。 ② 培养基中加入适当的抗菌素，以抑制细菌的生长。 常用的抗菌素： 金霉素：浓度为 30 μ g/mL ，可以抑制多数细菌的生长； 青霉素：浓度为 20 μ g/mL ，可以抑制革兰氏反应阳性细菌的生长； 多粘霉素： 浓度为 5 μ g/mL ，可以抑制革兰氏反应阴性细菌的生长； 链霉素：浓度为 40 μ g/mL ，可以抑制大部分细菌的生长； 氯霉素：浓度为 50 μ g/mL ，可以抑制大部分细菌的生长。 使用方法：除去氯霉素可在灭菌前加入外，其他抗菌素都应在培养基灭菌后 并冷却至 45 ℃ 左右时加入。 ③ 双层培养基法 真菌菌丝体能够穿透培养基，而细菌则没有这种能力。 5. 真菌培养性状的观察 培养真菌的目的主要是观察它的性状；研究环境条件对它的影响； 了解其生理生化特性。 （ 1 ）培养性状的观察：观察和描述真菌