水产品中氯霉素的快速检测胶体金免疫层析法.docx

精品文档 精品文档 PAGE PAGE5 精品文档 PAGE 附件5 水产品中氯霉素的快速检测 胶体金免疫层析法 （征求意见稿） 范围 本方法规定了水产品中氯霉素的胶体金免疫层析快速检测方法。 本方法适用于水产品中氯霉素的快速测定。 原理 本方法的测定以竞争抑制免疫层析原理为基础。 样品中的氯霉素经有机试剂提取， 固相萃取 小柱净化，浓缩复溶后，氯霉素与胶体金标记的特异性单克隆抗体结合， 抑制了抗体和微孔膜检 测线（T线）上抗原的结合，从而导致检测线颜色深浅的变化。通过检测线与控制线颜色深浅比 较，对样品中氯霉素含量进行定性判定。 3试剂和材料 除另有规定外，本方法所用试剂均为分析纯，水为 GB/T6682 规定的二级水。 3.1试剂 3.1.1 正己烷。 3.1.2 丙酮。 3.1.3 乙酸乙酯。 3.1.4 乙腈 3.1.5 磷酸二氢钠，NaH2PO4·2H2O。 3.1.6 磷酸氢二钠，Na2HPO4·12H2O。 3.1.7 氯化钠 3.1.8复溶液：称取0.12g磷酸二氢钠(3.1.5)置于100ml容量瓶中，用水溶解并稀释至刻度，制成溶液A；称取磷酸氢二钠7.16g(3.1.6)置于100ml容量瓶中，用水溶解并稀释至刻度，制成溶 液B。取溶液A2.8ml、溶液B7.2ml、氯化钠(3.1.7)0.85g，用水溶解并稀释至100ml，得磷酸盐缓冲液。 3.1.9丙酮-正己烷（1+9）：丙酮（3.1.2）、正己烷（3.1.1）按体积比 1：9混匀。 3.1.10丙酮-正己烷（6+4）：丙酮（3.1.2）、正己烷（3.1.1）按体积比 6：4混匀。 3.2标准物质 氯霉素参考物质的中文名称、英文名称、 CAS登录号、分之式、相对分子质量见表 1，纯度 98.6% 表1氯霉素参考物质中文名称、英文名称、 CAS登录号、分子式、相对分子质量 中文名称 英文名称 CAS登录号 分子式 相对分子量 氯霉素 chloramphenicol 56-75-7 C11H12CL2N2O5 323.13 注：或等同可溯源物质。 1 3.3标准溶液配制 3.3.1氯霉素标准储备液（ 1mg/mL）：精密称取氯霉素标准品（ 3.2）适量，置于 10mL容量瓶 中，用乙腈（3.1.4）溶解并稀释至刻度，摇匀，制成浓度为 1mg/mL 的氯霉素标准储备液。 4℃ 避光保存，有效期 6个月。 3.3.2氯霉素标准中间液 A（10μg/mL）：精密量取氯霉素标准储备液 （1mg/mL）（3.3.1）0.1mL， 置于10mL容量瓶中，用乙腈（ 3.1.4）稀释至刻度，摇匀，制成 10μg/mL的氯霉素标准中间液 A。4℃避光保存，有效期 3个月。 3.3.3氯霉素标准工作液（0.01μg/mL）：精密移取氯霉素标准中间液 A（10μg/mL）（3.3.2）0.01mL 分别置于 10mL容量瓶中，用乙腈稀释至刻度，摇匀，制成浓度为 0.01μg/mL的氯霉素标准工 作液。临用新配。 3.4材料 3.4.1固相萃取小柱： CleanertSilica，200mg/6ml。LOT：0170198 3.4.2免疫胶体金试剂盒（在 2℃～30℃、干燥阴凉条件下保存，在产品有效期内使用） 。 3.4.2.1金标微孔。 3.4.2.2试纸条或检测卡。 仪器和设备 4.1移液器：200μL、1mL和5mL。 4.2涡旋混合器。 4.3离心机：转速≥4000r/min。 4.4电子天平：感量为 0.01g。 4.5振荡器。 4.6样品浓缩仪： 如有需要。 4.7环境条件:温度：15℃～25℃，相对湿度： ≤60%。 分析步骤 5.1试样制备 取具有代表性样品约500g，充分粉碎混匀，均分成两份，分别装入洁净容器作为试样和留样，密封，标记，于常温保存。 5.2试样提取和净化 准确称取试样 6g（精确至 0.01g）置于50mL具塞离心管中，依次加入 4mL水和8mL乙酸 乙酯（3.1.3），涡旋提取 5min，以4000r/min离心5min。转移全部乙酸乙酯层于 50mL具塞离心 管中，加入正己烷 25ml，氯化钠 1g涡旋混匀，4000r/min离心1min，上清液待净化。 5ml丙酮 -正己烷（1+9）（3.1.9）淋洗LC-Si硅胶小柱，弃去淋洗液，将待净化溶液转移到固相萃取小柱 上，弃去流出液，用 5ml丙酮-正己烷（6+4）（3.1.10）洗脱，收集洗脱液，洗脱液于 40℃氮气 吹干，精密加入 600μL复溶液（3.1.8），涡旋混合 1min，作为待测液。 5.3测定步骤 5.3.1检测卡与金标微孔测定步骤 吸取150μL样品待测液于反应微孔（3.4.2.1）中，抽吸 5～10次使混合均匀，室温温育 3min； 温育结束后，将金标微孔中溶液滴加到检测卡