黄嘌呤氧化酶法测定抗氧化能力.docxVIP

集团文件版本号：（M928-T898-M248-WU2669-I2896-DQ586-M1988） 集团文件版本号：（M928-T898-M248-WU2669-I2896-DQ586-M1988） 黄嘌呤氧化酶法测定抗氧化能力 发酵过程产物形成的测定(SOD活性的测定) 实验目的 了解SOD活性测定的原理 学习黄嘌呤氧化酶法测定SOD活性 实验原理 原理：黄嘌呤氧化酶催化黄嘌呤产生超氧阴离子自由基，后者氧化羟胺成亚硝酸盐，亚硝酸盐在对氨基苯磺酸与甲萘胺作用下呈现紫红色，用可见光分光光度计测其吸光度。当被测样品中含SOD时，则对超氧阴离子自由基有专一性抑止作用，使可形成的亚硝酸盐减少，比色时测定管的吸光度值低于空白管的吸光度值，通过公式计算可求出被测样品中SOD 的活力。操作步骤：如表2-1。 三、实验试剂 硫酸盐缓冲液，盐酸羟胺，黄嘌呤，黄嘌呤氧化酶，醋酸等。 四、实验步骤 试剂 测定管 对照管 75mmol/L 磷酸盐缓冲液（pH7.8） 0.55 0.55 待测样品（ml） A(取样量) 0 0.1mol/L 盐酸羟胺溶液 0.05 0.05 75mmol/L 黄嘌呤溶液 0.05 0.05 0.037U/L 黄嘌呤氧化酶 0.05 0.05 双蒸水 0.2－A 0.2 用漩涡振荡器充分混匀，置37℃恒温水浴30min 显色剂（ml） 1 1 总体积1.9ml，混匀，室温放置10min，蒸馏水调零，测A530 五、计算方法 计算公式：每毫升反应液中SOD 抑止率达50％时对应的SOD 量为一个SOD 活力单位（U），待测样品中的SOD 活力由下式计算： SOD抑制率（％）＝（A2-A1）/A2×100% SOD 活力（U/ml）＝（A2-A1）/A2×100%÷50％×反应体系的稀释倍数×样本测试前的稀释倍数 式中：A1:测定管的吸光值；A2:空白管的吸光值 六、注意事项： 1.试管要洗干净，在测定微量样品时尤为重要。 2.要做空白管，并且放在所有测试管的中间做，取平均值。 常用试剂 （1）诱导剂：分别配制 IPTG 100μmol/mL； CuSO4·5H2O 250μm/mL； ZnSO4 100μm/mL。分别于0.22μm滤膜过滤除菌。 （2）稀释菌体所用0.02mol/L pH7.4 PBS 缓冲液： 8.5gNaCl，0.2gKCl，Na2HPO4·12H2O，3.628g，0.27gKH2PO4，定容至1000ml。 （3）SOD活性测定 ①75mmol/L 磷酸盐缓冲液（pH7.8）母液配制：A：0.15mol/L K2HPO4 配置：准确称取17.115g K2HPO4·3H2O 溶于500mL 蒸馏水中。B：0.15mol/L KH2PO4 配置：准确称取2.041g KH2PO4 溶于100mL 蒸馏水中。取母液A 91.5mL 与母液B8.5mL 充分混合后，用水稀释至终体积200mL，用酸或碱调pH 至7.8。 ②0.1mol/L 盐酸羟胺溶液（要求新鲜配置）准确称取6.949g 盐酸羟胺溶解于1ml 蒸馏水中。 ③75mmol/L 黄嘌呤溶液（要求新鲜配置）准确称取11.41g 黄嘌呤溶于1mlNaOH 稀释液中。NaOH 备用液：称0.8gNaOH 溶于50ml 水中，使用时稀释3 倍为0.133mol/LNaOH 稀释液。 ④0.037U/L 黄嘌呤氧化酶溶液（要求新鲜配置，避光） ⑤显色剂配制（避光保存）： A: 量取冰醋酸172.5ml 于500ml 棕色瓶中，称取0.2g 甲萘胺加入冰醋酸中。 B：称取2g 对氨基苯磺酸溶于100ml 蒸馏水中(对氨基苯磺酸不易溶解，在棕色瓶里用超声波处理，水温60－70℃) C：待对氨基苯磺酸完全溶解后与冰醋酸混合，加蒸馏水至终体积500ml。