糖尿病大鼠血管钙化的实验研究.docVIP

时间： TIME \@ yyyy年M月d日 2021年3月13日 学海无涯 页码：第 PAGE 1页共 NUMPAGES 1页 PAGE PAGE 1 糖尿病大鼠血管钙化的实验研究 血管钙化是动脉粥样硬化、肾病、衰老、高血压等多种疾病的病理生理基础［1-3］。血管钙化与动脉硬化斑块关系密切，氧化脂类物质和氧化应激引起的慢性炎症对血管钙化的发生、发展可能具有促进作用［4］。糖尿病是常见病、多发病，其患病率正随着人民生活水平的提高，人口老龄化，生活方式的改变而迅速增加。糖尿病是由于胰岛素分泌缺陷和(或)胰岛素作用缺陷而引起。糖尿病人群中动脉粥样硬化的患病率较高，发病年龄较轻，病情进展也较快。国外报道在糖尿病病人体内存在冠状动脉钙化、瓣膜钙化以及其他部位的血管钙化，从而导致冠心病等心血管疾病的发生，表明在高糖的环境中可以诱导细胞增殖和骨桥蛋白的表达［5］。但是糖尿病性大血管病变尤其是血管钙化间的关系目前未完全明了，糖尿病时发生血管钙化的确切机制也尚不清楚。本研究在大鼠血管钙化的模型上，观察糖尿病对血管钙化的影响，以探讨糖尿病与血管钙化间的关系及其可能机制。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料 雄性Sprague-Dawley大鼠180～200g，清洁级，由宁夏医科大学实验动物中心提供。链脲佐菌素(STZ)、尼古丁购自Sigma公司；维生素D3购自上海通用药材有限公司；大鼠骨钙素、TNF放免试剂盒购自北京科美东雅生物技术有限公司；碱性磷酸酶测试盒购自南京建成生物技术有限公司；其余试剂均为市售分析纯。 　　1.2 实验分组及大鼠模型的制备 参照文献［6-7］方法制备大鼠血管钙化和糖尿病模型，取24只雄性SD大鼠(体重180～200 g)，随机分为4组，每组6只。①钙化组(VDN)：维生素D3(300 000 IU/kg)肌肉注射，同时尼古丁(25 mg/kg 溶于花生油)灌胃，9h后尼古丁重复灌胃1次；②糖尿病组(DM)：将STZ 溶解于0.1 mol/L、pH 4.5、无菌的柠檬酸-柠檬酸三钠缓冲液中，制成浓度为12 mg/mL(1.2％)的STZ液，腹腔注射STZ 60mg/kg，72h 后血糖值≥16.67 mmol/L 为DM大鼠［8］；③钙化＋糖尿病组(VDN+DM，简称糖尿病干预组)：同时①②操作；④对照组(CON)：操作同①②，肌肉注射生理盐水和单纯花生油灌胃，腹腔注射等量的柠檬酸-柠檬酸三钠缓冲液。 　　饲养室内通风良好，室温18～25℃，相对湿度40％～70％，每日12h光照维持，昼夜循环，饲养时间为9～11月份。自由摄食、饮水。定期称重(每3天1次)，钙化处理6周后乌拉坦1 g/kg腹腔注射麻醉，心脏取血，肝素抗凝，分离血浆，-70℃冻存备用。摘取全长胸腹主动脉，取5 mm升主动脉用10％中性福尔马林固定，用于组织学观察，其余部分作下述测定。 　　1.3 血管组织总钙含量测定［8］ 　　取胸主动脉(约10mg)80℃烤干，加入2mol/L硝酸0.5mL，180℃消化并烤干，冷却后加入去离子水(含27nmol/L的氯化钾和27μmol/L的氯化镧)10 mL复溶，取2 mL加入1 %氯化锶100μL，原子吸收分光光度计(Jena，novAA300)在422.7nm 处读取吸光度，测定组织的钙含量(以μmol/g·dw 表示)。 　　1.4 血浆及血管组织碱性磷酸酶(ALP)活性测定 　　约10 mg胸主动脉，以等渗PBS 制备组织匀浆，4℃8 000×g离心10 min，吸取上清液，以考马斯亮蓝法行蛋白定量。按照ALP 测定试剂盒说明书，采用磷酸苯二钠(金氏)法测定ALP 活性(用U/mg·pro 表示)。 　　1.5 血浆及血管组织骨钙素(OC)和肿瘤坏死因子(TNF)浓度测定 　　主动脉用PBS 匀浆离心后，按照试剂盒说明书，采用放射免疫法测定血浆及主动脉骨钙素的浓度(用ng/g·pro 表示)和肿瘤坏死因子浓度(用ng/g·pro 表示)。 　　1.6 Von Kossa染色［8］ 　　血管组织进行石蜡包埋、切片，常规脱蜡、脱水后浸入5%的硝酸银溶液中，在日光下照射60 min，再用2.5%的硫代硫酸钠溶液处理5 min，然后依次用碱性品红复染，经脱水、透明、封固，在光镜下观察。 　　1.7 统计学方法 　　数据以均值±标准差表示(±s)，两样本均数间比较采用t检验，多样本均数间比较采用One-way ANOVA检验，组间的两两比较采用Student-Newman-Keuls(SNK)方法检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。 　　2 结果 　　2.1 大鼠血管钙化特征 　　血管Von Kossa 染色见钙化组血管，尤其是中膜弹性纤维间有大量黑色颗粒，沉积于细胞外基质和平滑肌细胞内，部