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JAK／STAT信号通路在DON和T-2毒素对RAW264．7细胞毒性作用中的机制研究JAK／STAT信号通路在DON和T．2毒素对洲264．7细胞毒性 JAK／STAT信号通路在DON和T-2毒素对RAW264．7细胞毒性作用中的机制研究 JAK／STAT信号通路在DON和T．2毒素对洲264．7细胞毒性 作用中的机制研究 专业： 兽医药理学与毒理学 20ll届硕士研究生：柳芹 指导老师：袁宗辉教授 (国家兽药残留基准实验室(HZAU)／农业部食品安全评价重点开放实验室， 华中农业大学中国武汉430070) 摘 要 单端孢霉烯毒素是由镰刀菌产生的真菌次级代谢产物，为世界范围内许多国家 地区食品和饲料中的主要污染性霉菌毒素。T-2毒素和脱氧雪腐镰刀菌烯醇 (Deoxynivalenol，DON)分别为单端孢A类、B类具有代表性的两种真菌毒素，它们 对人和动物存在广泛的毒性效应，能严重损伤机体的免疫系统。动物实验表明，在 低剂量下，该类毒素能快速激活免疫相关炎性细胞因子基因水平的早期表达，引起 免疫刺激：在高剂量下，能严重损伤淋巴结、脾脏等免疫器官，诱导白细胞凋亡， 导致白细胞数量降低，引起免疫抑制。该类毒素能与核糖体结合，一方面抑制蛋白 质等生物大分子的合成，另一方面通过引起核糖体应激反应，快速激活MAPK通路， 调控相关基因的转录活性及mRNA的稳定性并诱导免疫相关及炎性相关基因的表 达。大量研究表明炎性细胞因子在单端孢类霉烯毒素的毒性效应中发挥了关键的作 用，炎性细胞因子在单端孢类霉烯毒素诱导下的过度表达能引发IgA肾病、白细胞 凋亡并导致机体免疫功能紊乱。JAK／STAT是一条与炎性细胞因子传导密切相关的 信号通路，它在单端孢类霉烯毒素所介导的毒性效应中是否起到了调控作用，目前 并不清楚。由于巨噬细胞是该类毒素作用最为敏感的靶细胞，因此本研究将以 RAW264．7小鼠单核巨噬细胞为模型，并引入AG490和Stattic等通路特异性抑制剂， 初步阐明JAK／STAT路径在DON和I-2毒素对RAW264．7单核巨噬细胞中的毒性作 用，探讨该通路在DON和T-2毒素诱导细胞凋亡及细胞增殖过程中潜在的分子机制。 本研究采用MTT法检测DON(O．25～16州)和T-2毒素(5～320 riM)对RAW264．7 细胞株分别作用和24 h后细胞增殖的影响，发现DON和T-2毒素能够抑制 RAW264．7细胞增殖，表现出时间及剂量依赖性的毒性效应：在加或不加JAK／STAT 信号通路特异性抑制剂AG490(10弘M和5 pM分别为AG490与DON或T-2毒素 华中农业大学2011届硕士研究生学位论文共同孵育的浓度)和StaRic(10 华中农业大学2011届硕士研究生学位论文 共同孵育的浓度)和StaRic(10 pM和5州分别为Staaic与DON或T．2毒素共同 孵育的浓度)的情况下，采用实时荧光定量PCR方法检测DON(14州)或T-2毒 素(7～28 nM)作用RAW264．7细胞12 h后，JAK／STAT信号通路中JAKl～3、STATl-3、 负反馈调节蛋白细胞因子信号抑制因子SOCS及炎性细胞因子IL．6、IL．1p、TNF．O mRNA的表达情况。结果显示DON和T-2毒素能够剂量依赖性的激活IL．6、IL．18、 TNF．O及JAKI、JAK2、STATl—STAT3和SOCS基因的表达，但对JAK3的激活效 应不明显，AG490和StaRie能够抑制DON和T-2毒素诱导的JAK2和STATI～3的 基因表达；采用Western blot方法定量研究DON(2 pM)或T-2毒素(14 riM)作用 RAW264．7细胞12 h后STATI、p-STATl(Try701)、STAT3和p-STAT3(Tyr705)蛋白 表达的影响，结果显示DON和T-2毒素能够显著诱导P．STATl和P．STAT3的蛋白 表达，使S仉玎l和STAT3磷酸化水平增强，在JAK／STAT通路抑制剂AG490和StaRic 的干预下，P．STATI和p-STAT3的蛋白表达水平呈现不同程度的下降，与荧光定量 PCR基因表达结果一致；在AG490和StaRic的干预下，由DON(2州)和T-2毒素 04 nM)诱导的IL-6、IL．1p和n师．a基因表达均显著受到了抑制。以上结果说明DON 和T-2毒素能够分别在mRNA和蛋白水平激活JA刚STAT通路，该通路在DON和 T-2毒素诱导炎性细胞因子IL．6、IL．1B和TNF．O基因表达的过程中发挥了重要的调 控作用。JAK／STAT通路负反馈调节因子SOCS基因表达的升高，表明SOCS可能 对DON和T-2毒素诱导IL．6等炎性细胞因子的生成起到了适度负性调节作用，一 定水平