上调促进非小细胞肺癌生长的作用机制及临床意义.docxVIP

关于学位论文使用授权的说明本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保 关于学位论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保 留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借 阅。本人授权大连医科大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 本学位论文属于(请在以下相应方框内打“√”)： 1．保密口，在 年解密后适用本授权书。 2．不保密毗 作者签名：f毳次 日期：加f睁岁,El t b n 剔磁锄a陶 日期：a口，占年歹月，b日 万方数据 目 目 录 一、摘要 1 (一)中文摘要 ·1 (二)英文摘要 ·4 二、正文 8 ，，——、一言(一) ·8HU 舌 。 (二)材料和方法 10 1．材料 ·10 2．方法 ·13 3．统计学方法 一26 (三)结果 一27 (四)讨论 一42 (五)结论 一43 (六)参考文献 45 三、综述 ·49 (一)综述 49 (二)参考文献 54 四、攻读学位期间发表文章情况 60 五、致谢 61 5 万方数据 hnRNPA2／B hnRNPA2／B 1上调COX．2促进非小细胞 肺癌生长的作用机制及临床意义 中文摘要 目的： COX．2(环氧合酶．2，cyclooxygenase一2)在肿瘤细胞中高表达，被作为肿瘤标 志物。目前研究己发现COX．2在肿瘤细胞中有多种启动子结合蛋白，这些调控因 子如何差异性地与COX．2启动子结合，调控COX．2表达及参与肿瘤形成的具体 分子机制尚不明确。本研究通过启动子结合蛋白垂钓鉴定系统，并且联合蛋白质 组学质谱技术，鉴定能够与COX．2启动子区相结合的蛋白，并鉴定出其中之一为 hnRNPA2／B 1(核不均一核糖核蛋白A2／B 1，heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A2／B1)。进一步，为了明确hnRNPA2／B1对COX．2的调控机制及生物学功能，选 择不同肺癌细胞系，敲低或过表达hnRNPA2／B1之后，探索hnRNPA2／B1对COX．2 的表达调控，COX．2启动子驱动的活性，并分析hnRNPA2／B1对COX．2下游产 物的影响；为了在裸鼠体外成瘤模型中验证hnRNPA2／131调控COX．2与细胞学实 验中的机制研究结果一致，对成瘤的裸鼠进行hnRNPA2／B1 siRNA治疗后，动态 观察裸鼠肿瘤体积大小及体重的变化，使用裸鼠肿瘤组织检测hnRNPA2／B1与 COX．2表达的相关性；最后，通过对临床标本中hnRNPA2／B1和COX．2在肺癌 细胞和正常癌旁组织中的表达情况，分析hnRNPA2／B1与COX．2表达的相关性， 分析高表达hnRNPA2／B1和COX．2的患者预后因素，评估其与肺癌分期、生存、 转移、复发等的相关性。深入研究hnRNPA2／B1对COX．2表达调控的分子机制及 明确hnRNPA2／B1的临床意义。旨在确立hnRNPA2／B1／COx．2作为肺癌治疗新靶 点提供理论和实验依据。 方法： 使用DNA结合蛋白垂钓方法(Biotin．Streptavadin·Agarose Pulldown)，联合蛋 白质组学质谱技术，蛋白鉴定hnRNPA2／B1与COX．2启动子特异性结合。在非小 细胞肺癌细胞系A549，H322，H460，H1299中，使用染色质免疫共沉淀CHIP及 万方数据 Pull Pull down方法验证hnRNPA2／B 1与COX．2启动子区结合。在非小细胞肺癌细胞 系及肺癌组织中，使用Western blot，RT-PCR及免疫组化检测hnRNPA2／B 1，COX．2 等表达情况。选取H460或H1299肺癌细胞系敲低或高表达hnRNPAB之后，用 RT-PCR、Western Blot检测在转录水平及翻译水平COX．2的变化，ELISA方法检 测细胞培养基中PGE2含量，用荧光报告基因检测hnRNPA2／B1对COX．2启动子 活性的影响，用划痕实验检测细胞迁移能力，用MTT实验检测细胞增殖及细胞 活力。使用免疫共沉淀Co．IP检测蛋白之间的相互作用，并在hnRNPA2／B1过表 达的情况下敲低p300表达或阻断p300活性，以及在p300过表达的情况下敲低 hnRNPA2／B1，观察二者对于COX．2表达和肺癌细胞增殖的协同调控。建立肺癌 的小鼠皮下移植肿瘤模型，观察不同组别之间裸鼠肿瘤形成和生长速度，评价使 用hnRNPA2／B1 siRNA对裸鼠肿瘤治疗的疗效。采用组织芯片、免疫组化、Western Blot等技术检测肺癌组织和正常癌旁组织标本中hnRNPA2／B1和COX．