植物细胞融合实验.pptxVIP

一、细胞融合的目的和意义 细胞融合能实现远缘杂交。其意义在于打破了仅仅依赖有性杂交重组基因创造新种的界限，有可能形成有性杂交方法无法获得的新型杂种植物，广泛组合各种基因型，扩大了遗传物质的重组范围。;二、细胞融合（cell fusion)概念 在外力（诱导剂或促融合剂）作用下，两个或两个以上的异源细胞或原生质体相互接触，从而发生膜融合、胞质融合和核融合并形成杂种细胞的现象。 通过细胞培养技术，这个细胞有可能发育成完整的生物个体，这个杂种后代有可能兼有两个上代的一些优良性状。 ;细胞在融合过程中发生的主要变化： 呈致密状态的体细胞在促融合剂的作用下，细胞膜的性质发生变化。 首先出现细胞凝集现象；然后部分凝集细胞之间的膜发生粘连；继而融合形成多核细胞；在培养过程中多核细胞又进行核的融合而成为单核的杂种细胞，而那些不能形成单核的融合细胞在培养过程中逐渐死亡。;三、细胞融合技术原理和方法  由于体外培养的细胞很少会发生自发融合（融合频率大约在10-4~10-6之间），因此要采用生物、化学或物理的方法人为地促使细胞融合。 ;促细胞融合的方法有：（一）病毒促进细胞融合 其中仙台病毒（HVJ）是最早用于动物细胞融合的融合剂。（二）化学融合剂促进细胞融合 主要包括盐类融合剂、聚乙二醇（PEG）、二甲亚砜（DMSO）、甘油-醋酸酯、油酸盐、脂质、Ca2+配合物等。 （三）电处理融合法;聚乙二醇（polyethylene glycol,PEG)融合 在众多的化学试剂中，PEG应用最为广泛，因PEG液比病毒更易制备和控制、活性稳定、使用方便、而且促进细胞融合的能力更强。PEG是一种多聚化合物。;PEG诱导原生质体融合的机理：  带有大量负电荷的PEG与水之间的氢键结合，使溶液中自由水消失，由于高度脱水引起原生质体凝集，形成大小程度不同的凝集物。原生质体发生皱缩并大大扭曲变形，邻近原生质体之间紧密接触。;  在原生质体细胞膜与膜紧密接触的部位，膜内蛋白质颗粒易位并凝聚。接着可能是相邻的剥去蛋白质的细胞膜间的类脂质与类脂质反应。继之，类脂质分子的扰动和重排导致接触的细胞膜局部发生融合，形成很小的细胞质桥，之后它逐渐扩大，两个原生质体最终融合。 ; 使用化学促融剂时，Ca2+是必需的。关于Ca2+的作用机理，有的认为是Ca2+和PO43-形成不溶于水的配合物，成为细胞间的钙桥，由此引起融合。也有解释为Ca2+结合到带负电磷脂的电离基上，使磷脂分子在膜上相互分离，由此引起融合。;电融合（electrofusion technique)法： 电处理融合法是20世纪80年代发展起来的细胞融合技术，使融合率大为提高。;Electroporator 2510 from Brinkmann;电融合过程的分子机制： 是以电降解及双向电泳的联合作用为基础。通过电泳，两细胞膜紧密接触，且膜表面的蛋白质分子分离，产生了无蛋白的类脂区。; 电脉冲作用时引起膜结构局部扰乱，出现小孔洞。而相对的脂双层间分子在范德华力作用下，形成脂分子桥。由于连接处的细胞膜表面曲率大，处于高张力状态，在热力学上是不稳定的，所以最终导致两细胞逐渐融合成一个圆形的大球状细胞。;A Alignment: Cells are brought into close contact by means of dielectrophoresis.;Fusion phases of oat protoplasts (Avena sativa);实际操作： 先把待融合的细胞或原生质体混合，取样置于100V/cm的高频交流电场中，在非均匀交流电场中形成项链状排列；; 再用1~5V/cm直流电脉冲/微秒冲击细胞或原生质体的粘接点，细胞膜降解造成若干微孔，于是在膜之间形成通道，使细胞质得以交换；最后导致新的球状细胞的形成。;电融合法优点（与PEG法比较）：1、融合率高；2、重复性强；3、诱导仅发生在质膜接触部位，对细胞 或原生质体伤害小；4、融合是在同步状态下进行，活细胞数目多；5、装置精巧，方法简单，可在显微镜下观察或录像融合过程；6、免去PEG诱导后的洗涤过程，诱导过程可控制性强。;四、实验材料、试剂和仪器1.材料 无菌烟草叶片、洋葱根尖;2.试剂1）酶混合液 配制分两部进行：（1）将CaCl2.2H2O 7 mmol/L  NaH2PO4.2H2O