基因工程综合实验.pptxVIP

;异丙基硫代-β-D-半乳糖昔（IPTG）;SDS电泳: 不同的蛋白质分子具有不同的电荷和分子量。蛋白质在强阴离子去污剂SDS与某一还原剂(如二巯基乙醇)共同作用下并加热使蛋白质解离后，变性的蛋白质与SDS结合并因此而带负电荷，不同的蛋白质结合SDS的量仅与分子量成正比而与氨基酸的序列无关，在SDS电泳时，蛋白质在聚丙烯酰胺中的迁移率仅仅取决于蛋白质的分子量。 聚丙烯酰胺凝胶电泳由丙烯酰胺单体和交联剂N，N′—亚甲基双丙烯酰胺在催化剂作用下，形成三维网状结构。凝胶电泳不仅具有分辨不同分子量蛋白质的作用(即分子筛作用)，还具有浓缩作用。由于不连续缓冲系统具有把样品中的SDS-多肽复合物全部浓缩于极小体积的能力，从而提高了分辨率。采用考马斯亮蓝快速染色，可及时观察电泳分离效果。;大肠杆菌高效表达外源基因须遵循基本原则;1、优化表达载体的设计 ;2、提高稀有密码子 tRNA 的表达作用。 ;3、提高外源基因 mRNA 的稳定性。 ;4、提高外源基因表达产物的稳定性 ;5、优化培养与诱导过程;;pET-22b（+）质粒图谱; 1、蛋白质的诱导表达 （1）将含有外源基因的单菌落加入到10ml含有Amp的LB培养基 中，37℃220rmp过夜培养（14-16小时）。 （2）取300μl培养液于10ml无抗生素的LB培养基（1:100）， 37℃220rmp培养45分钟，至菌液OD600≌0.4-1.0（最好0.6），加入40μl IPTG至终浓度为1mmol/L，继续诱 导培养2-3小时。 （3）取上述菌液1ml于离心管中，并以未诱导的空白载体的细 菌培养物为对照，冰上放置5分钟，离心（6000rmp）1 分钟。 （4）在沉淀中加入100μl的1×凝胶加样缓冲液，沸水中加热5 分钟。离心（12000rmp）1分钟， （5）取上清进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。;2、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 （1）制备分离胶 按下表配制分离胶。 ;（2）制备浓缩胶 制备方法按下表相对比例混合所需溶液，用少量灌入玻璃板间隙中，冲洗分离胶胶面，然后倒出。把余下的倒入玻璃板间隙中，使液面与玻璃板凹槽处齐平，插入梳子，室温放置20-30min。凝聚后小心拔出梳子。取出梳子后向形成的胶孔加入蒸馏水，冲洗出未凝聚的丙烯酰胺等，倒出孔中水，再加入电极缓冲液。;（3）将灌好胶的玻璃板垂直固定在电泳槽上，带凹槽的玻璃板与电泳槽紧贴在一起，形成一个贮液槽，向其中加入电极缓冲液液，使其与胶孔中的缓冲液相接触。在电泳槽下端的贮液槽中也加入电极缓冲液。 （4）加样：加样的量应适中，样品中至少含有0.25μg的蛋白质，染色后才能检测得出，1.0μg的蛋白质则十分明显。样品的点样体积根据样品溶液的浓度和凝胶孔的大小，可在20μL。加样时用微量进样器（50-100μL体积）吸取已处理好的标准蛋白质样品20μL（或根据商品说明加样）。 1X 凝胶电泳加样缓冲液： 50 mmol/L Tris-CI(pH6.8) 50 mmol/L DTT 2% SDS 0.1% 溴酚蓝 10% 甘油 ;;3、染色和脱色 将分离胶部分取下，放在盛有染色液的染色槽中浸泡30min左右。倒去染色液，用蒸馏水漂洗一次，然后加入脱色液，室温浸泡凝胶或者放在摇床上振动脱色，更换几次洗脱液，直至蛋白质区带清晰。;思考题;实验八 农杆菌介导的烟草基因转化;;Ti质粒作为基因转化的载体形式：;;; 影响农杆菌介导基因转化效率的因素：;3、 侵染浓度和时间 浓度过高、时间过长会引起农杆菌细胞间的竞争性抑制，而且过度增殖会抑制受体细胞的呼吸作用； 浓度过底、时间过短则造成受体细胞表面农杆菌附着不足。 禾谷类作物一般侵染浓度较高，接种浓度为OD600＝1.0－2.0；侵染时间1-2小时。 烟草、大白菜等对侵染敏感的双子叶植物要求菌体浓度要低的多,一般为OD600= 0.5；侵染时间5－10分钟。;4、 共培养条件 （1）共培养温度 农杆菌在20~30℃的范围内都可以生长 vir区基因表达的适宜温度多在20~25℃ 共培养温度25 ℃左右 外植体生长温度通常在25－26 ℃左右 （2）共培养PH值 酸性培养环境有利于农杆菌的侵染。因为植物细胞释放的对农杆菌有趋化作用的化学物质（如酚类、糖类）虽然在不同酸碱度下比较稳定，但在pH=5.0－5.8时对vir基因的诱导能力最高。 ; （3）诱导物和抑制物 酚类是vir区