第3章基因工程载体精简版.ppt

第3章基因工程载体精简版 λ噬菌体载体的体外包装 基本概念 转染：寄主细胞直接捕获裸露的噬菌体DNA分子的过程，称为转染 转导：以成熟的噬菌体颗粒去感染大肠杆菌称为转导 第3章基因工程载体精简版 体外包装 就是指经过重组携带有外源DNA片 段的裸露的噬菌体载体DNA分子在体 外通过一系列的反应包上蛋白质外 壳和尾部蛋白而具有感染性的成熟 噬菌体颗粒 参与包装的四个基因 E 基因：其产物主要是头部蛋白，E基因突变的噬菌体不能形成头部结构，在其感染的大肠杆菌中可积累大量的尾部蛋白 D基因：其主要产物位于噬菌体头部的外侧，同λDNA进入头部前体及头部的成熟有关， D基因突变的噬菌体，λDNA不能进入头部，在其感染的大肠杆菌中积累大量的头部前体蛋白 W和FII：其产物是将头部和尾部连接在一起最终形成成熟的噬菌体颗粒 第3章基因工程载体精简版 包装的过程 分别从被E基因突变的噬菌体感染的大肠杆菌和D基因突变噬菌体感染的大肠杆菌中分离尾部蛋白和头部蛋白。 利用头部蛋白和尾部蛋白的体外互补作用将重组体分子包装成为成熟的噬菌体颗粒 第3章基因工程载体精简版 体内包装 第3章基因工程载体精简版 体外装配 （in vitro packaging） T4 噬 菌 体 的 体 外 包 装 头部蛋白 尾部蛋白 第3章基因工程载体精简版 二、粘粒载体 什么是粘粒载体： 粘粒载体是一类由人工构建的包含λ DNA的COS序列和质粒的复制子的特殊类型的质粒载体 第3章基因工程载体精简版 粘粒载体的特点 具有λ DNA片段的COS位点，在其两侧还具有与噬菌体包装有关的DNA短序列 具有一个完整的质粒DNA的复制子，编码着一个复制起点和两个抗菌素抗性基因Ampr和tetr 具有λ噬菌体体外包装，高效的感染特性 具有质粒载体的特点：易于克隆、选择、高拷贝 具有高容量的克隆能力 具有与同源序列的质粒进行重组的能力 第3章基因工程载体精简版 第三节 人工染色体 (artificial chromosome) 酵母人工染色体（YAC) 细菌人工染色体(BAC) 第3章基因工程载体精简版 染色体关键部位 着丝粒 端粒 自主复制序列 第3章基因工程载体精简版 酵母人工染色体（YAC）的构建 酵母人工染色体载体的结构 酵母自主复制序列（ARS） 酵母着丝粒DNA序列（CEN） 端粒DNA序列（TEL）：来自于四膜虫大核rDNA分子的末端 筛选标记：与营养缺陷型菌株互补 引入克隆位点 第3章基因工程载体精简版 表达质粒载体 pGEM3Z载体的结构及外源DNA的转录 第3章基因工程载体精简版 胞内表达载体 分泌型表达载体 原核细胞表达载体 真核细胞表达载体 第3章基因工程载体精简版 大肠杆菌表达载体具备: 强启动子 核糖体结合位点序列 强转录终止序列 信号肽编码序列 表达载体与克隆载体之区别 第3章基因工程载体精简版 植物表达载体 第3章基因工程载体精简版 多功能载体 具有体外转录、克隆、基因表达、测序等 功能 第3章基因工程载体精简版 穿梭载体(shuttle plasmid vector) 具有两种不同复制起点和筛选标记， 可在两种不同的宿主中存活复制的质粒载体 穿梭质粒类型 大肠杆菌—土壤农杆菌 大肠杆菌—酿酒酵母 大肠杆菌—枯草芽孢杆菌 大肠杆菌—动物细胞 第3章基因工程载体精简版 第二节 噬菌体载体与粘粒载体 λ噬菌体载体 粘粒载体 第3章基因工程载体精简版 一、 λ噬菌体载体 λ噬菌体作为克隆载体的优越性 λ噬菌体的分子生物学概述 λ噬菌体载体的构建 λ噬菌体载体的类型 λ噬菌体的体外包装 第3章基因工程载体精简版 λ噬菌体作为克隆载体的优越性 克隆容量大：噬菌体载体与质粒载体相比具有更强的容纳外源DNA的片段的能力。噬菌体载体最大可以克窿23Kb外源DNA 感染率高：每个噬菌体颗粒的感染率几乎是100%，而质粒DNA分子大约仅有0.1%的转化率 噬菌体基因组可以整合到寄主染色体上与寄主染色体一起复制 安全：噬菌体较质粒的宿主范围要窄的多，因而也就更加安全 第3章基因工程载体精简版 λ噬菌体的生物学特性 λ噬菌体的生活周期 溶菌周期 溶源周期