真核基因在大肠杆菌中表达.ppt

真核基因在大肠杆菌中的表达;内容提纲;第一节 真核基因的大肠杆菌表达体系;1. 大肠杆菌表达体系;背景清楚，特别是对其基因表达调控的分子机理研究的比较深入。 安全(被FDA批准为安全的基因工程受体生物)，且有多种不同的菌株和质粒载体。 已有许多真核基因在大肠杆菌中实现高效表达。 培养方便、操作简单、成本低廉，因此易于进行批量生产。;真核基因与原核基因的差别：编码基因的不连续性，含有内含子序列，大肠杆菌不具备对pre-RNA进行加工剪接的能力。 mRNA分子结构的差异：真核基因mRNA 5’-端有帽子结构，3’-端有poly(A)尾巴，影响其稳定性及与细菌核糖体结合的能力。;;转录信号的不同：真核基因转录的mRNA不具备结合细菌核糖体所必须的SD序列；细菌的RNA聚合酶不能识别真核启动子。;蛋白质产物的后修饰：许多真核基因的蛋白质产物存在翻译后的修饰过程，如磷酸化、糖基化等。大肠杆菌中无此过程，因此，表达的蛋白无法正确折叠，由此产生的三级结构通常是不可溶的，常形成包涵体，无活性。 蛋白酶的降解：表达的真核蛋白质被细菌的蛋白酶识别并降解。;解决方案;2. 克隆基因正确表达的基本条件;另一个重要条件：编码的蛋白质产物应能维持正常的稳定性 表达蛋白被大肠杆菌蛋白酶降解。 蛋白质三级结构形成的速率与其稳定性有关。 蛋白质三级结构的正确形成需要分子伴侣的参与。 大肠杆菌不可能对所有外源蛋白都存在正确的分子伴侣。;第二节 大肠杆菌的表达载体;;1. 表达载体的基本成分;转录终止子（TT） 上游启动子会抑制下游启动子的转录功能(启动子封堵作用)，因此需要在克隆基因编码区的3’-末端接上一个有效的转录终止子。 转录终止子能增强mRNA分子的稳定性，从而提高蛋白质产物的水平。;翻译起始序列：决定mRNA翻译起始效率。 未鉴定出其保守结构，只能采取一些方法降低mRNA 5’-末端二级结构的形成，增加RBS中A、T含量，碱基定点突变等。;;;;;;增强子：特殊的序列元件，能显著增强外源基因的表达效率。 翻译终止子：必须存在终止密码子。 构建表达载体时通常装上全部的三个终止密码子 (UAA,UGA,UAG)，以阻止核糖体的??跃现象。 大肠杆菌最偏爱的密码子：UAA 当为四联核苷酸UAAU时，终止效率进一步增强。;2. 常用的大肠杆菌表达载体; Lac启动子的表达载体;lac操纵子受lac阻遏物的负调节。 培养基中缺乏乳糖或其它诱导物时， lac阻遏物同操纵单元结合，关闭乳糖操纵子的活动。 培养基中加入乳糖或其它诱导物(IPTG)时，同阻遏物结合，使乳糖操纵子去阻遏。 因此，我们可以通过加入IPTG诱导来实现外源基因的表达。;Lac操纵子的控制区，包括核糖体结合区、RNA聚合酶结合区及阻遏物结合区都位于长203 bp的HaeIII片断上。 203 bp的HaeIII片断含有Lac启动子、操纵单元及β-半乳糖苷酶的前8个密码子。 将该片断插入到质粒中，构建含有lac启动子的质粒表达载体。;这种多拷贝质粒中的操纵单元可以把大肠杆菌中所有的Lac阻遏物都结合掉，使细菌染色体的β-半乳糖苷酶基因解抑制。 含有质粒载体（Lac启动子、操纵单元）的大肠杆菌能够合成β-半乳糖苷酶，因此菌落在加有X-gal(底物)的琼脂平板上呈蓝色。 这种显色反应可用来快速鉴定阳性克隆。;T7 噬菌体启动子：它是来自T7噬菌体的启动子，具有高度的特异性。 只有T7 RNA聚合酶才能使其启动，故可以使克隆化基因独自得到表达。T7 RNA聚合酶的效率比大肠杆菌 RNA聚合酶高5倍左右 ;真核基因在大肠杆菌中表达;第三节 真核基因在大肠杆菌中的表达;1. 外源蛋白在大肠杆菌中的表达部位;;解决方案：限制包涵体的形成 ⑴ 外源基因与分子伴侣共表达 分子伴侣：能够阻止聚合作用而使蛋白质正确折叠。 ⑵ 使用硫氧还蛋白缺陷的寄主菌株 目的：维持有利的氧化还原电位 ⑶ 低温诱导，降低蛋白质的合成速率 ⑷ 与高可溶性的多肽融合表达;;;;1. 稀释复性：直接加入水或缓冲液，放置过夜，缺点是体积增加较大，变性剂稀释速度太快，不易控制。稀释法主要有一次稀释、分段稀释和连续稀释三种方式。 2. 透析复性：好处是不增加体积，通过逐渐降低外透液浓度来控制变性剂去除速度，但可能形成无活性蛋白质聚体，且不适合大规模操作，无法应用到生产规模。 3. 超滤复性：在生产中较多的使用，规模较大，易于对透析速度进行控制，缺点是不适合样品量较少的情况，且有些蛋白可能在超滤过程中不可逆的变性。 　　;4. 柱上复性：是最近研究较多并成功的在生产中应用的一种复性方法，包涵体蛋白变性后，在色谱柱上复性，大致可分成疏水柱复性及凝胶柱复性两类。其中的凝胶柱复性均是用Sephacry1S-100