乙型肝炎的病原学诊断.pptxVIP

分子生物学实验;一、实验目的;二、实验原理;PCR技术基本原理;目的基因扩增;三、实验准备;三、实验准备;移液器;高速离心机;PCR扩增仪;荧光定量PCR扩增仪;电泳仪;暗室中紫外灯观察结果;（一）乙肝病毒DNA提取（热裂解法） 1、分离血清 2、50ul血清加入50 ul裂解液混匀。 3、沸水浴煮10分钟。 4、15000转离心15分钟。 5、取上清到另一离心管中备用。;分离血清;加入裂解液提取DNA;热 裂 解;高 速 离 心;三、实验步骤;配制PCR反应液;三、实验步骤;扩增产物分析;1．分区操作：PCR具有超敏感性，因此在检测过程中应分区操作，即分为样品处理区，PCR扩增区，产物分析区。 2、试验前实验室应使用紫外消毒至少30分钟，实验器械应用70％乙醇擦拭。 3．操作时戴一次性手套，加样头要求及时更换，吸液时避免飞溅。 ;4．每天实验前，在废物缸内套上塑料袋，加入半缸含有效氯1%次氯酸钠液，实验时将吸头、离心管丢入废液缸中浸泡。 5、EP管在开盖前应离心片刻。 6、所有试剂试验前充分融化，避免反复冻融。 7、每次PCR反应均应设立阴阳性对照。 ;试验实设置与管理;PCR室的管理与防污染;;试剂准备室管理制度 ;;样品制备室管理制度;产物分析区管理制度 ;定量PCR概念;常规PCR与定量PCR的比较;实时荧光定量PCR原理;Ct值与起始模板的关系;荧光定量的标准曲线 ;除常规的一对引物以外，PCR反应体系中另加有一个能与PCR产物杂交的荧光双标记探针。该探针的5端标记一个荧光基团，3标记另一个荧光基团。此时5端荧光基团吸收能量后将能量转移给临近的3’端荧光淬灭基团（发生FRET），因此正常情况下检测不到该探针5端荧光基团发出的荧光信号。;但当溶液中有模板时，模板变性后低温退火时，引物与探针同时与模板结合。在引物的介导下，沿模板向前延伸至探针结合处，发生链的置换； ;Taqman探针原理;实时荧光定量PCR无需内标;定量PCR在临床诊断治疗上的意义;定量PCR在乙肝检测中意义;;;;;HBV DNA 定量检测能提前做出预后判断;LightCycler;谢谢！;9、有时候读书是一种巧妙地避开思考的方法。1月-211月-21Saturday, January 30, 2021 10、阅读一切好书如同和过去最杰出的人谈话。12:38:1112:38:1112:381/30/2021 12:38:11 PM 11、越是没有本领的就越加自命不凡。1月-2112:38:1112:38Jan-2130-Jan-21 12、越是无能的人，越喜欢挑剔别人的错儿。12:38:1112:38:1112:38Saturday, January 30, 2021 13、知人者智，自知者明。胜人者有力，自胜者强。1月-211月-2112:38:1112:38:11January 30, 2021 14、意志坚强的人能把世界放在手中像泥块一样任意揉捏。30 一月 202112:38:11 下午12:38:111月-21 15、最具挑战性的挑战莫过于提升自我。。一月 2112:38 下午1月-2112:38January 30, 2021 16、业余生活要有意义，不要越轨。2021/1/30 12:38:1112:38:1130 January 2021 17、一个人即使已登上顶峰，也仍要自强不息。12:38:11 下午12:38 下午12:38:111月-21