流式细胞仪分析技术及应用.pdfVIP

第二十二章 流式细胞仪分析技术及应用 本章要点 1. 流式细胞仪的分析及分选原理 2. 数据的显示与分析 3. 流式细胞仪免疫分析的技术要求 4. 流式细胞术在免疫学检查中的应用 概述：流式细胞术（ FCM）是以流式细胞仪为检测手段的一项能快速、精确地对单个细胞理化特性进行 多参数定量分析和分选的新技术。流式细胞仪的发展综合了激光技术、计算机技术、显微荧光光度测定技 术、流体喷射技术、分子生物学和免疫学等多门学科的知识。流式细胞仪：是集光电子物理，光电测量， 计算机，细胞荧光化学，单抗技术为一体的高科技细胞分析仪。 第一节 流式细胞仪的分析及分选原理 流式细胞计的基本结构流式细胞计主要由四部分组成。它们是：流动室和液流系统；激光源和光学系 统；光电管和检测系统；计算机和分析系统。 一、工作原理 （一）基本组成结构 1. 流动室和液流系统：流动室由样品管、鞘液管和喷嘴等组成，常用光学玻璃、石英等透明、稳定的 材料制作。设计和制作均很精细，是液流系统的心脏。样品管贮放样品，单个细胞悬液在液流压力作用下 从样品管射出；鞘液由鞘液管从四周流向喷孔，包围在样品外周后从喷嘴射出。为了保证液流是稳液，一 般限制液流速度 10m／s 。由于鞘液的作用，被检测细胞被限制在液流的轴线上。流动室上装有压电晶体， 受到振荡信号可发生振动。 2. 激光源和光学系统：经特异荧光染色的细胞需要合适的光源照射激发才能发出荧光供收集检测。常 用的光源有弧光灯和激光；激光器又以氩离子激光器为普遍，也有配合氪离子激光器或染料激光器。光源 的选择主要根据被激发物质的激发光谱而定。氩离子激光器的发射光谱中，绿光 514nm和蓝光 488nm 的谱 线最强，约占总光强的 80%；氪离子激光器光谱多集中在可见光部分，以 647nm较强。免疫学上使用的一些 荧光染料激发光波长在 550nm 以上，可使用染料激光器。将有机染料做为激光器泵浦的一种成份，可使原 激光器的光谱发生改变以适应需要即构成染料激光器。例如用氩离子激光器的绿光泵浦含有 Rhodamine 6G 水溶液的染料激光器， 则可得到 550 ～650nm 连续可调的激光， 尤在 590nm处转换效率最高， 约可占到一半。 为使细胞得到均匀照射，并提高分辨率，照射到细胞上的激光光斑直径应和细胞直径相近。因此需将激光 光束经透镜会聚。色散棱镜用来选择激光的波长，调整反射镜的角度使调谐到所需要的波长 λ，为了进一 步使检测的发射荧光更强，并提高荧光讯号的信噪比，在光路中还使用了多种滤片。带阻或带通滤片是有 选择性地使某一滤长区段的光线滤除或通过。例如使用 525nm带通滤片只允许 FITC （异硫氰荧光素）发射 的 525nm绿光通过。长波通过二向色性反射镜只允许某一波长以上的光线通过而将此波长以下的另一特定 波长的光线反射。在免疫分析中常要同时探测两种以上的波长的荧光信号，就采用二向色性反射镜，或二 向色性分光器，来有效地将各种荧光分开。 3. 光电管和检测系统：经荧光染色的细胞受合适的光激发后所产生的荧光是通过光电转换器转变成电 信号而进行测量的。光电倍增管（ PMT）最为常用。 PMT的响应时间短，仅为 ns 数量级；光谱响应特性好， 在 200 ～900nm的光谱区，光量子产额都比较高。光电倍增管的增益从 103 到 108 可连续调节，因此对弱光 测量十分有利。光电管运行时特别要注意稳定性问题，工作电压要十分稳定，工作电流及功率不能太大。 一般功耗低于 0.5W；最大阳极电流在几个毫安。此外要注意对光电管进行暗适应处理，并注意良好的磁屏 蔽。在使用中还要注意安装位置不同的 PMT，因为光谱响应特性不同，不宜互换。也有用硅光电二极管的， 它在强光下稳定性比 PMT好。 从 PMT输出的电信号仍然较弱，需要经过放大后才能输入分析仪器。流式细胞计中一般备有两类放大 器。一类是输出信号辐度与输入信号成线性关系，称为